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1. 大肠杆菌一般是将葡萄糖作为碳元素的来源。但是当环境中没有葡萄糖而有乳糖时，大肠杆菌的基因就会迅速表达出与乳糖代谢有关的3种酶：一种是β—半乳糖苷透过酶，它促使乳糖通过细胞膜进入细胞；另一种是β—半乳糖苷酶，催化乳糖水解成半乳糖和葡萄糖；第三种是β—半乳糖苷转乙酰基酶。在这3种酶的作用下，大肠杆菌就能够将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖并加以利用。而当大肠杆菌生活的环境中没有乳糖时，大肠杆菌的基因就不会表达出有关酶。过程见下图所示，请回答有关问题。

   

(1) 终止子是，其位于结构基因的。
(2) 大肠杆菌的PR启动子（选填“属于”或“不属于”）诱导型启动子，理由是。
(3) 大肠杆菌中，Z、Y和A基因转录形成的是（选填“1条”“2条”或“3条”）mRNA，依据是。
(4) 当环境中存在乳糖时，大肠杆菌的乳糖操纵子的调节机制可维持细胞中结构基因表达产物水平的相对稳定，此过程属于（选填“正反馈”或“负反馈”）调节，理由是。
【考点】
基因工程的操作程序（详细）;
【答案】

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1. 转基因生物培育成功的关键是保证目的基因在受体中的正常表达或抑制特定基因的表达。在这个过程中，根据获得的目的基因不同、采取的措施不同等，培育时选择的方法也不相同。回答下列相关问题：

（1）利用乳腺生物反应器获得胰岛素的过程中，为保证通过反转录法获得的胰岛素基因能正常表达，在构建基因表达载体时需将获得的含目的基因的片段连接在之间，然后通过的方法将基因表达载体导入中。

（2）为降低耐除草剂转基因水稻通过花粉传播而引起的环境生物安全问题，一是利用转入的耐除草剂基因的位置进行控制，如；二是将耐除草剂基因拆分为两部分，只有两部分片段同时存在才具有耐除草剂的特性，请提出可行的措施：。

（3）下图中插入颠倒的转录区的目的是，其原理可能是颠倒的转录区与转录区形成的RNA通过原则形成双链而无法使转录区形成的RNA与核糖体结合。
综合题 困难
2. 为更好地利用农杆菌转化玉米，科学家将基因编辑系统引入农杆菌Ti质粒对其进行改造。
(1) Ti质粒在基因工程中常作为。改造后的Ti质粒的部分序列如图1所示，转入玉米细胞后，gRNA能够与玉米细胞DNA特定位点结合，从而引导Cas9蛋白在此位点切断键断开DNA．HR1和HR2与玉米DNA切断位点上下游序列同源，玉米细胞能以同源序列之间的序列为模板合成一段DNA，连接断开的DNA分子，实现外源片段插入。图1中插入玉米染色体的片段能稳定表达和扩增，其他区域的基因只能瞬时表达且无法扩增。在转化玉米的过程中，使用改造后的Tⅰ质粒的优点是。

注：HRA为抗除草剂基因：NPTⅡ为卡那霉素抗性基因
(2) 用上述改造后的农杆菌转化玉米幼胚，在培养基中加入除草剂或均能筛选出已发生转化的幼胚。对培养后的植株进行PCR（引物设计如图2），部分植株实验结果如图3。

电泳结果显示号玉米中成功插入了外源基因，自交后（选填“会”或“不会”）发生性状分离。
(3) 标记基因插入转基因作物染色体中往往会影响植物的生长发育，并带来环境安全隐患。现要制备转耐寒CXE-20基因的转基因玉米，请利用该方法设计Ti质粒相关序列，选择相关基因的序号填入Ti质粒部分序列示意图。

①Cas9   ②gRNA   ③HRA   ④NPTⅡ   ⑤CXE-20   ⑥HR1   ⑦HR2
综合题 普通
3. 近年来随着甲醇工业产能过剩的情况日益严重，研究人员通过构建甲醇工程菌来有效利用甲醇。RuMP途径是目前研究较多的甲醇同化途径之一，其中MDH酶是同化甲醇的关键酶之一，现科学家利用下图质粒构建表达载体，制备可利用甲醇的大肠杆菌。

(1) 为了使目的基因能与图示质粒高效正确构建表达载体，需在目的基因的两端加上的碱基序列。（编号选填）

①EcorR I②Kpn I③Acc65 I       ④Bgl Ⅱ
(2) 结合上述信息，以下叙述正确的是       。 A. 受体细胞应选取氨苄青霉素敏感型 B. 可以使用Ca2+处理大肠杆菌，使重组质粒能够被其吸收 C. 培养受体细胞的培养基必须加入甲醇 D. 目的基因成功表达的标志是受体细胞能在培养基上生长
(3) 待培养12h后，挑取单菌落分离DNA进行PCR扩增，若扩增后的DNA样品电泳结果显示有968bp和1566bp两个片段，则下图（深色部分为目的基因区段）中对应两个片段的引物组合分别为和。（请用图8中编号选填）
(4) 检测上述构建的甲醇工程菌，其MDH的表达量远高于一般大肠杆菌，但仍无法确定是否成功构建能同化甲醇能力较强的工程菌。下列叙述中能支持该观点的是     。 A. 尚未对工程菌合成的相关蛋白的活性进行测定 B. 尚未对工程菌分解甲醇的能力进行鉴定 C. 尚未在个体生物学水平进行抗原-抗体杂交 D. 尚未对目的基因进行碱基序列的测定和比较
(5) 利用DNA探针（单链DNA）能与待测样本中mRNA互补结合形成双链复合杂交体，从而可确定受体细胞中是否含有目的基因。检测发现部分受体细胞无目的蛋白却有目的基因，原因可能是表达过程中的过程受阻；现拟对原因做出进一步的精准判断，请简要写出实验思路和预期结果：。
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