转基因生物培育成功的关键是保证目的基因在受体中的正常表达或抑制特定基因的表达。在这个过程中，根据获得的目的基因不同、采取的措施不同等，培育时选择的方法也不相同。回答下列相关问题：（1）利用乳腺生物反应器获得胰岛素的过程中，为保证通过反转录法获得的胰岛素基因能正常表达，在构建基因表达载体时需将获得的含目的基因的片段连接在之间，然后通过的方法将基因表达载体导入中。（2）为降低耐除草剂转基因水稻通过花粉传播而引起的环境生物安全问题，一是利用转入的耐除草剂基因的位置进行控制，如；二是将耐除草剂基因拆分为两部分，只有两部分片段同时存在才具有耐除草剂的特性，请提出可行的措施：。（3）下图中插入颠倒的转录区的目的是，其原理可能是颠倒的转录区与转录区形成的RNA通过原则形成双链而无法使转录区形成的RNA与核糖体结合。

1. 为更好地利用农杆菌转化玉米，科学家将基因编辑系统引入农杆菌Ti质粒对其进行改造。

(1) Ti质粒在基因工程中常作为。改造后的Ti质粒的部分序列如图1所示，转入玉米细胞后，gRNA能够与玉米细胞DNA特定位点结合，从而引导Cas9蛋白在此位点切断键断开DNA．HR1和HR2与玉米DNA切断位点上下游序列同源，玉米细胞能以同源序列之间的序列为模板合成一段DNA，连接断开的DNA分子，实现外源片段插入。图1中插入玉米染色体的片段能稳定表达和扩增，其他区域的基因只能瞬时表达且无法扩增。在转化玉米的过程中，使用改造后的Tⅰ质粒的优点是。

注：HRA为抗除草剂基因：NPTⅡ为卡那霉素抗性基因

(2) 用上述改造后的农杆菌转化玉米幼胚，在培养基中加入除草剂或均能筛选出已发生转化的幼胚。对培养后的植株进行PCR（引物设计如图2），部分植株实验结果如图3。

电泳结果显示号玉米中成功插入了外源基因，自交后（选填“会”或“不会”）发生性状分离。

(3) 标记基因插入转基因作物染色体中往往会影响植物的生长发育，并带来环境安全隐患。现要制备转耐寒CXE-20基因的转基因玉米，请利用该方法设计Ti质粒相关序列，选择相关基因的序号填入Ti质粒部分序列示意图。

①Cas9 ②gRNA ③HRA ④NPTⅡ ⑤CXE-20 ⑥HR1 ⑦HR2

综合题普通

2. 大肠杆菌一般是将葡萄糖作为碳元素的来源。但是当环境中没有葡萄糖而有乳糖时，大肠杆菌的基因就会迅速表达出与乳糖代谢有关的3种酶：一种是β—半乳糖苷透过酶，它促使乳糖通过细胞膜进入细胞；另一种是β—半乳糖苷酶，催化乳糖水解成半乳糖和葡萄糖；第三种是β—半乳糖苷转乙酰基酶。在这3种酶的作用下，大肠杆菌就能够将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖并加以利用。而当大肠杆菌生活的环境中没有乳糖时，大肠杆菌的基因就不会表达出有关酶。过程见下图所示，请回答有关问题。

(1) 终止子是，其位于结构基因的。

(2) 大肠杆菌的P_R启动子（选填“属于”或“不属于”）诱导型启动子，理由是。

(3) 大肠杆菌中，Z、Y和A基因转录形成的是（选填“1条”“2条”或“3条”）mRNA，依据是。

(4) 当环境中存在乳糖时，大肠杆菌的乳糖操纵子的调节机制可维持细胞中结构基因表达产物水平的相对稳定，此过程属于（选填“正反馈”或“负反馈”）调节，理由是。

综合题困难

3. 近年来随着甲醇工业产能过剩的情况日益严重，研究人员通过构建甲醇工程菌来有效利用甲醇。RuMP途径是目前研究较多的甲醇同化途径之一，其中MDH酶是同化甲醇的关键酶之一，现科学家利用下图质粒构建表达载体，制备可利用甲醇的大肠杆菌。

(1) 为了使目的基因能与图示质粒高效正确构建表达载体，需在目的基因的两端加上的碱基序列。（编号选填）

①EcorR I②Kpn I③Acc65 I ④Bgl Ⅱ

(2) 结合上述信息，以下叙述正确的是。 A. 受体细胞应选取氨苄青霉素敏感型 B. 可以使用Ca²⁺处理大肠杆菌，使重组质粒能够被其吸收 C. 培养受体细胞的培养基必须加入甲醇 D. 目的基因成功表达的标志是受体细胞能在培养基上生长

(3) 待培养12h后，挑取单菌落分离DNA进行PCR扩增，若扩增后的DNA样品电泳结果显示有968bp和1566bp两个片段，则下图（深色部分为目的基因区段）中对应两个片段的引物组合分别为和。（请用图8中编号选填）

(4) 检测上述构建的甲醇工程菌，其MDH的表达量远高于一般大肠杆菌，但仍无法确定是否成功构建能同化甲醇能力较强的工程菌。下列叙述中能支持该观点的是。 A. 尚未对工程菌合成的相关蛋白的活性进行测定 B. 尚未对工程菌分解甲醇的能力进行鉴定 C. 尚未在个体生物学水平进行抗原-抗体杂交 D. 尚未对目的基因进行碱基序列的测定和比较

(5) 利用DNA探针（单链DNA）能与待测样本中mRNA互补结合形成双链复合杂交体，从而可确定受体细胞中是否含有目的基因。检测发现部分受体细胞无目的蛋白却有目的基因，原因可能是表达过程中的过程受阻；现拟对原因做出进一步的精准判断，请简要写出实验思路和预期结果：。

综合题困难

1. 噬菌体展示技术（如下图）可将某些蛋白质呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定。以下对该技术的分析错误的是（　　）

A. 建立噬菌体展示库需限制性核酸内切酶和DNA连接酶 B. 可利用抗原抗体杂交技术筛选目标蛋白 C. 用含有碳源、氮源等营养物质的液体培养基扩大培养噬菌体 D. 该技术可用于获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因

单选题普通

2. 下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是（）

A. 将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法 B. 将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌 C. 将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌 D. 目的基因成功导入的标志是受体细胞能产生出人的生长激素

单选题普通

3. 乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如下图所示。下列关于该过程的分析不合理的是（）

A. 转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性 B. 可以利用PCR技术筛选含有L-PG基因的受体细胞 C. 通过同源重组实现酵母菌的PD基因被替换为L-PG基因 D. 标记基因Amp^r可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株

单选题普通

1. 丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域，兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。下图为部分过程，表为部分限制酶识别序列及切割位点。

限制性内切核酸酶	BamHⅠ	XhoⅠ	BclⅠ	SacⅠ
识别序列及切割位点	5'-C↓GATCG-3'	5'-C↓TCGAG-3'	5'-↓GATC-3'	5'-GAGCT↓C-3'

(1) 扩增X基因时，PCR反应中需要使用加入的材料有。（编号选填）

①解旋酶②耐热的DNA聚合酶③特异性引物④DNA模版链⑤脱氧核苷三磷酸底物⑥DNA编码链

(2) 为获得重组质粒，可在X基因两端添加。（编号选填）

①XhoⅠ和BclⅠ的识别序列②SacⅠ和BclⅠ的识别序列③XhoⅠ和BamHⅠ的识别序列④SacⅠ和BamHⅠ的识别序列

(3) 重组质粒转化入大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上．在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是。

(4) 实验发现，大肠杆菌培养基中pH偏低，分析原因可能是______。 A. 碳源不足 B. 杂菌发酵 C. 氮源过多 D. 无机盐过少

(5) 兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g·L^-1和15g·L^-1 ，在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90g·L^-1、100g·L^-1、110g·L^-1）和酵母粉（12g·L^-1、15g·L^-1 ， 18g·L^-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置（填数字）组实验（重复组不计算在内）。

(6) 研究发现，将X基因编码组氨酸定点突变为酪氨酸可提高丁二醇的产量．已知X基因编码链第468-488位碱基序列为5'-GATACA…GGACATGGG…ACGAAT-3'。为实现上述突变，应设计的引物序列是。（编号选填）（组氨酸：CAU、CAC 酪氨酸：UAU、UAC）

①3'-CTATGT-5' ②5'-GGATATGGG-3' ③3'-GATACA-5'④3'-GGAATAGGG-5'⑤5'-ATTCGT-3'⑥5'-CCCATATCC-3'⑦5'-GATAGA-3' ⑧3'-CCTTATGGG-5'

(7) 除采用PCR技术获得单碱基突变基因外，还可以对上述单碱基编辑技术获得定点突变目的基因，你倾向于选择哪种技术获得定点突变基因？阐述理由。

综合题困难

2. 利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面（穿过细胞膜展示在细胞表面），诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1所示，Nco I和Sac I是pNZ8149质粒上的限制酶识别位点，U-M为信号肽-细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题：

(1) 为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加，并在（填“有氧”或“无氧”）的环境条件下培养。

(2) 拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的5'端应分别添加序列，以实现融合基因定向插入质粒。

(3) 为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，泳道2为双酶切pNZ8149-3RBD。泳道1两个条带大小分别为2507bp和2020bp，由此可知，融合基因3RBD的长度为bp，泳道2呈现一个条带的原因是。

(4) 实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，pNZ8149-2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149-3RBD菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明。

综合题困难

3. 亚洲棉的光籽（无短绒）和毛籽（有短绒）是一对相对性状，为探究棉绒的遗传规律并揭示其发育的分子机制，研究者进行了系列实验。

(1) 利用表型为光籽的不同突变体与野生型毛籽棉进行杂交，统计F₁自交结果如下表：

据表可知，突变体甲光籽性状的遗传遵循定律；②组F₂光籽棉中的纯合子所占比例为；推测③组F₁测交后代表型及比例为。综合三组杂交实验结果，表明之间并非简单的一一对应关系。

组别	亲本	F₂表型及比例
①	突变体甲×毛籽棉	光籽：毛籽＝3：1
②	突变体乙×毛籽棉	光籽：毛籽＝13：3
③	突变体丙×毛籽棉	光籽：毛籽＝9：7

(2) 研究发现，8号染色体的~880kb至~903kb区间与突变体甲的光籽表型相关。根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物，提取突变体甲和野生型的基因组DNA进行PCR，产物扩增结果如下。

据图可知分子量较大的扩增产物与点样处的距离较（选择“大”或“小”填写），推测8号染色体上第对引物对应的区间（简称M）是突变体甲光籽出现的根本原因。

(3) 研究者对杂交组合①的F₂进行扩增，证实甲的光籽表型与区间M密切相关。得出此结论的扩增结果应该是。

(4) 研究者从野生型和突变体甲中克隆出区间M，构建表达载体后分别导入棉花原生质体，检测基因表达水平，结果如下。

内参基因REN是为了排除载体转化效率不同对实验结果的干扰，因此图中LUC/REN用来衡量的表达水平。实验结果说明区间M突变后下游基因的表达，且其作用的发挥与有关。

(5) 基因GaFZ的表达会影响棉花短绒的发育，检测发现突变体甲GaFZ蛋白结构与野生型一致。综合上述研究推测突变体甲光籽表型出现的原因是。

实验探究题困难

1. 下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（）

A. 分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列 B. 该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上 C. 若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组 D. 获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异

单选题困难

2. 下列关于基因工程的叙述，正确的是（）

A. 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B. 抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C. 抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D. 已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置

单选题困难

3. 甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F₁ ，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种。以下对相关操作及结果的叙述，错误的是（）

A. 将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞 B. 通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定 C. 调整培养基中植物激素比例获得F₁花粉再生植株 D. 经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体

单选题普通