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1. 巢式聚合酶链式反应（Nested PCR）属于普通PCR的衍生技术，相较于普通PCR，巢式PCR能有效提高产物中目的基因的比例，增加PCR的灵敏度和特异性。巢式PCR通常包括两个连续的扩增反应，每个反应使用不同的一对引物。第一次PCR用一对外引物进行扩增，其产物会被用作第二次PCR的模板，第二次PCR由一对内引物（结合位点位于外引物对结合点的内部）扩增目的基因，过程如下图所示。

   

(1) 巢式PCR反应体系所需的试剂如下，请补齐空白处：

PCR反应缓冲液（含有MgCl2）

dNTP混合液（所有四种dNTP，即dATP、dTTP、dCTP、dGTP）

引物：内引物1，内引物2，外引物1，外引物2

模板 DNA

H2O

其中 PCR反应缓冲液中Mg2+的作用是，相比直接使用4种脱氧核苷酸，在反应体系中加入dNTP的优势有。
(2) 与普通PCR相比巢式PCR中设计的引物只是在模板DNA的结合位置有所差异。进行巢式PCR前，根据已知的模板DNA序列，可设计合成内外引物对，引物设计的要求有（答出两点即可）；同时，为方便扩增产物后续的操作，可在引物的（填“5＇端”或“3＇端”）添加限制性内切核酸酶位点。
(3) 将题（1）中试剂按顺序加入扩增离心管中，按下表参数在PCR仪中进行扩增：

周期数

变性

复性

延伸

1-30

94℃下30s

50℃下30s

72℃下2.5min

在扩增后对PCR的产物进行电泳鉴定时发现出现较多的非特异性条带，此时可适当（填“提高”或“降低”）复性温度来减少非特异性条带，原因是。
(4) 巢式PCR可大大提高扩增特异性的原因是。
【考点】
PCR技术的基本操作和应用;
【答案】

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1. 家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。巢式PCR中的两次PCR使用了2对不同引物，先使用外引物对目标区域DNA片段进行第一次PCR扩增，产生中间产物，然后使用内引物对中间产物进行第二次PCR扩增，产生目标产物。下图是巢式PCR工作原理示意图。回答下列问题：

(1) 巢式PCR反应体系中需要加入的原料是，巢式PCR过程用代替解旋酶，为激活反应体系中的DNA聚合酶，还需要加入。
(2) 相比于常规PCR获得的产物，巢式PCR获得的产物特异性。
(3) 科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上的雄性决定基因（SRY）和常染色体上的酪蛋白基因（CSN1S1），用以进行早期胚胎的性别鉴定，并对鉴定后的胚胎进行移植。

①取囊胚的滋养层细胞提取DNA，原因是。

②根据牛的SRY和CSN1S1基因序列共可设计合成对引物。

③PCR过程：预变性→变性→复性→延伸。

④观察扩增结果：电泳分析。

⑤对符合要求的胚胎进行移植，在操作过程中不需要对受体提供免疫抑制剂，原因是。
综合题 困难
2. 非洲猪瘟病毒（ASFV）可感染家猪及野猪，病死率高达100%。抗原蛋白的选择和单克隆抗体的制备是相关疫苗研发的基础。CP312R是ASFV中最具免疫原性的蛋白之一。我国学者利用基因工程和细胞融合技术，成功制备了CP312R蛋白和相应单克隆抗体。

请回答：

(1) 获取目的基因。通过访问互联网，检索获得CP312R蛋白基因序列，采用法合成目的基因。
(2) 设计引物与扩增目的基因。

根据目的基因序列，设计和合成引物。据下表分析，引物1、引物2上分别添加了、限制酶识别序列。

限制酶及识别序列

引物名称及序列（5'+3'）

EcoRI

5'GAATTC3'

引物1：CTAGTCTAGAATGACTACCCACATCTTCCACCCTG

PstI

5'CTGCAG3'

引物2：AAACTGCAGTTAGTGGTGATGGTGGT

GGTGGTGGTGAGCGATAGCGATTTG

XbaI

5'TCTAGA3'

PCR扩增时，应选耐高温的聚合酶。

A．以DNA为模板的RNA                    B．以RNA为模板的RNA

C．以DNA为模板的DNA                    D．以RNA为模板的DNA
(3) 重组质粒的构建与鉴定。

经两种限制酶切割后的目的基因和质粒在DNA连接酶的作用下通过键连接起来，能正确表示这个过程的图像是（填写序号）。

重组质粒经双酶切、电泳分离后，若电泳结果出现个条带表明重组质粒构建成功。电泳时，琼脂糖凝胶作为介质起到的作用，起到电泳指示剂的作用。若电泳时指示剂过早迁移出凝胶，下列调整措施合理有哪些?。

A．调整电泳的时间                           

B．调整指示剂上样量

C．调整加样孔朝向正极                    

D．调整电泳仪电压和温度

E．调整凝胶中琼脂糖的浓度
(4) CP312R蛋白与单克隆抗体的制备。

利用基因工程制备的CP312R蛋白作为，刺激小鼠使其发生免疫反应；诱导从小鼠脾脏分离的与骨髓瘤细胞融合；融合得到的杂交瘤细胞必需经过和，才能获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。与体外培养获得单克隆抗体相比，从小鼠腹水中提取单抗的优点是。（答出2点即可）
综合题 困难
3. 人们所需要的大部分核酸的碱基对数量远远超过DNA合成仪可以合成的最长核酸链的碱基对数量，而这种大片段基因的人工合成则可以利用重叠延伸PCR的方法（合成过程如图所示）。据图分析回答下列问题。

(1) 利用重叠延伸PCR人工合成大片段基因，首先需要设计n条单链寡核苷酸片段作为引物（如图中P1~P15），合成这些引物的前提是已知。根据图示分析，相邻近的每2条引物之间均有15~25bp的序列，若第1轮循环需要加入引物P6~P9 ， 请在下图中标注出每个引物的位置。
(2) 第1轮循环（填“需要”或“不需要”）添加模板；第2轮循环选择Px和Py分别对应引物。图示多轮循环（填“能”或“不能”）在同一个PCR体系中完成，原因是。
(3) 利用重叠延伸PCR人工合成大片段基因相对于普通PCR还需要用到酶；结合上述内容分析利用该技术合成基因的优势有。
综合题 普通