1. 家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。巢式PCR中的两次PCR使用了2对不同引物,先使用外引物对目标区域DNA片段进行第一次PCR扩增,产生中间产物,然后使用内引物对中间产物进行第二次PCR扩增,产生目标产物。下图是巢式PCR工作原理示意图。回答下列问题:

(1) 巢式PCR反应体系中需要加入的原料是,巢式PCR过程用代替解旋酶,为激活反应体系中的DNA聚合酶,还需要加入
(2) 相比于常规PCR获得的产物,巢式PCR获得的产物特异性
(3) 科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上的雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1),用以进行早期胚胎的性别鉴定,并对鉴定后的胚胎进行移植。

①取囊胚的滋养层细胞提取DNA,原因是

②根据牛的SRY和CSN1S1基因序列共可设计合成对引物。

③PCR过程:预变性→变性→复性→延伸。

④观察扩增结果:电泳分析。

⑤对符合要求的胚胎进行移植,在操作过程中不需要对受体提供免疫抑制剂,原因是

【考点】
PCR技术的基本操作和应用;
【答案】

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1. 巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)属于普通PCR的衍生技术,相较于普通PCR,巢式PCR能有效提高产物中目的基因的比例,增加PCR的灵敏度和特异性。巢式PCR通常包括两个连续的扩增反应,每个反应使用不同的一对引物。第一次PCR用一对外引物进行扩增,其产物会被用作第二次PCR的模板,第二次PCR由一对内引物(结合位点位于外引物对结合点的内部)扩增目的基因,过程如下图所示。

   

(1) 巢式PCR反应体系所需的试剂如下,请补齐空白处:

PCR反应缓冲液(含有MgCl2

dNTP混合液(所有四种dNTP,即dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

引物:内引物1,内引物2,外引物1,外引物2

模板 DNA

H2O

其中 PCR反应缓冲液中Mg2+的作用是,相比直接使用4种脱氧核苷酸,在反应体系中加入dNTP的优势有

(2) 与普通PCR相比巢式PCR中设计的引物只是在模板DNA的结合位置有所差异。进行巢式PCR前,根据已知的模板DNA序列,可设计合成内外引物对,引物设计的要求有(答出两点即可);同时,为方便扩增产物后续的操作,可在引物的(填“5'端”或“3'端”)添加限制性内切核酸酶位点。
(3) 将题(1)中试剂按顺序加入扩增离心管中,按下表参数在PCR仪中进行扩增:

周期数

变性

复性

延伸

1-30

94下30s

50℃下30s

72℃下2.5min

在扩增后对PCR的产物进行电泳鉴定时发现出现较多的非特异性条带,此时可适当(填“提高”或“降低”)复性温度来减少非特异性条带,原因是

(4) 巢式PCR可大大提高扩增特异性的原因是
综合题 普通
2. 非洲猪瘟病毒(ASFV)可感染家猪及野猪,病死率高达100%。抗原蛋白的选择和单克隆抗体的制备是相关疫苗研发的基础。CP312R是ASFV中最具免疫原性的蛋白之一。我国学者利用基因工程和细胞融合技术,成功制备了CP312R蛋白和相应单克隆抗体。

请回答:

(1) 获取目的基因。通过访问互联网,检索获得CP312R蛋白基因序列,采用法合成目的基因。
(2) 设计引物与扩增目的基因。

根据目的基因序列,设计和合成引物。据下表分析,引物1、引物2上分别添加了限制酶识别序列。

限制酶及识别序列

引物名称及序列(5'+3')

EcoRI

5'GAATTC3'

引物1:CTAGTCTAGAATGACTACCCACATCTTCCACCCTG

PstI

5'CTGCAG3'

引物2:AAACTGCAGTTAGTGGTGATGGTGGT

GGTGGTGGTGAGCGATAGCGATTTG

XbaI

5'TCTAGA3'

PCR扩增时,应选耐高温的聚合酶。

A.以DNA为模板的RNA                    B.以RNA为模板的RNA

C.以DNA为模板的DNA                    D.以RNA为模板的DNA

(3) 重组质粒的构建与鉴定。

经两种限制酶切割后的目的基因和质粒在DNA连接酶的作用下通过键连接起来,能正确表示这个过程的图像是(填写序号)。

重组质粒经双酶切、电泳分离后,若电泳结果出现个条带表明重组质粒构建成功。电泳时,琼脂糖凝胶作为介质起到的作用,起到电泳指示剂的作用。若电泳时指示剂过早迁移出凝胶,下列调整措施合理有哪些?

A.调整电泳的时间                           

B.调整指示剂上样量

C.调整加样孔朝向正极                    

D.调整电泳仪电压和温度

E.调整凝胶中琼脂糖的浓度

(4) CP312R蛋白与单克隆抗体的制备。

利用基因工程制备的CP312R蛋白作为,刺激小鼠使其发生免疫反应;诱导从小鼠脾脏分离的与骨髓瘤细胞融合;融合得到的杂交瘤细胞必需经过,才能获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。与体外培养获得单克隆抗体相比,从小鼠腹水中提取单抗的优点是。(答出2点即可)

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