凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，研究人员利用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中并使之表达。如图表示EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ三种限制酶在质粒和含凝乳酶基因的外源DNA片段上的切割位点．回答下列问题：（1）根据图中EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ三种限制酶的切割位点分析，该工程中最不适宜用来切割外源DNA获取目的基因的限制酶是，将切割后的质粒和目的基因连接起来需要酶．构建好的重组质粒在目的基因前要加上特殊的启动子，它是识别和结合的部位。（2）工业化生产过程中，若采用重组大肠杆菌生产凝乳酶，该过程中将目的基因导入大肠杆菌前，常常用处理细胞，使之处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态，这种细胞称为细胞。（3）研究发现，如果将该凝乳酶第20位和第24位氨基酸改变为半胱氨酸，其催化能力将提高2倍。科学家可以生产上述高效凝乳酶的现代生物工程技术是。该生物工程技术对蛋白质结构的设计和改造，必须通过基因来完成，原因是。

1. 将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。

注：F1-F3、R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；Kan^R表示卡那霉素抗性基因；HygB^R表示潮霉素B抗性基因。

(1) 本操作中获取目的基因的方法是和。

(2) 穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是，驱动目的基因转录。

(3) 根据图中穿梭质粒上的Kan^R和HygB^R两个标记基因的位置，用基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。

(4) 为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是和。

(5) 本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白

综合题普通

2. 幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、胃食管反流病等多种疾病有关。科研人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，通过基因工程制备出相应的疫苗，操作流程如图所示。回答下列问题：

(1) 通过PCR获取Ipp20基因时需要提取幽门螺杆菌的DNA，提取过程中为了将DNA与蛋白质初步分离，使用体积分数为95%的酒精的原理是。在设计一对引物时，在引物序列的端(填“5’”、“3’”或“5’和3’”)中增加两种限制酶的识别序列，便于过程②构建基因表达载体和后续筛选。

(2) 过程③用处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。

(3) 据图分析，培养基A中添加的抗生素是（填“潮霉素”或“氯霉素”），培养基B中添加的抗生素是（填“潮霉素”或“氯霉素”），可用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落（填图中数字）中。

(4) 随着科技的发展，科研人员设计预期的蛋白质结构，利用蛋白质工程研发效果更好、稳定且易保存的新型疫苗成为可能。其中利用氨基酸序列逆推出目的基因中的核苷酸序列，运用的原理为。

综合题普通

3. 金属硫蛋白（MT）属于重金属结合蛋白，能够吸收土壤中的镉，蚯蚓的体内富含 MT，可通过基因工程技术将蚯蚓 MT 基因转入烟草中，使烟草获得结合重金属的能力。回答下列问题：

（1）获取 MT 基因：从蚯蚓组织中提取 mRNA，用于构建文库。

（2）构建基因表达载体：用两种不同限制酶切割质粒与目的基因的目的是（答出1 点即可）。

（3）导入受体细胞：烟草为双子叶植物，科研人员常用法将基因表达载体导入受体细胞，利用该方法可使目的基因在受体细胞中得以稳定维持和表达的机制是。

（4）目的基因的鉴定：个体水平对目的基因是否翻译出具有功能的蛋白质进行鉴定的方法是。

（5）利用转基因烟草修复重金属镉污染土壤的优点有（答出 2 点即可）。

综合题普通

1. 萤火虫的荧光素酶能催化ATP激活的荧光素氧化发光，这一现象在生物检测和成像方面有重要的应用价值。为了解决天然荧光素酶不能高效催化人工合成的荧光素DTZ发光的问题，研究人员采用蛋白质工程（又称为第二代基因工程）对它进行了改造。下列关于蛋白质工程改造天然荧光素酶的叙述，正确的是（）

A. 通过化学诱变剂可定向改造天然荧光素酶的基因序列 B. 改造天然荧光素酶所用的基因表达载体不需要启动子和终止子 C. PCR技术可用于检测染色体DNA上是否插入荧光素酶基因 D. 改造后的荧光素酶在一定条件下催化DTZ发光是将化学能转化为光能

多选题普通

2. 乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如下图所示。下列关于该过程的分析不合理的是（）

A. 转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性 B. 可以利用PCR技术筛选含有L-PG基因的受体细胞 C. 通过同源重组实现酵母菌的PD基因被替换为L-PG基因 D. 标记基因Amp^r可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株

单选题普通

3. 噬菌体展示技术（如下图）可将某些蛋白质呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定。以下对该技术的分析错误的是（　　）

A. 建立噬菌体展示库需限制性核酸内切酶和DNA连接酶 B. 可利用抗原抗体杂交技术筛选目标蛋白 C. 用含有碳源、氮源等营养物质的液体培养基扩大培养噬菌体 D. 该技术可用于获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因

单选题普通

1. 天然微生物来源的内切葡聚糖酶产量低，极大地制约了其生产和应用。内切葡聚糖酶高效异源表达是解决这一问题的有效途径。科研人员从绿色木霉中获得了纤维素内切葡聚糖酶基因EgⅢ，并将其导入毕赤酵母中，成功构建了工程菌（如图），实现了高效降解固体废物中纤维素的目的。

回答下列问题：

(1) 在构建基因表达载体时，应选择的限制酶是，以避免目的基因与质粒反向连接。启动子通常具有物种及组织特异性，应选择来源于的启动子。

(2) 将重组质粒导入大肠杆菌的目的是，此外还可查询并设计引物，提取绿色木霉为模板，采用逆转录PCR技术达到此目的。筛选含有重组质粒的大肠杆菌应使用的抗生素是，理由是。

(3) 科学家为调整纤维素内切葡聚糖酶的最适pH，欲对酶分子结构进行改造，设计了酶分子的氨基酸序列，进而利用基因工程技术改变EgIII基因中的核苷酸序列，最终显著地改变了该酶的最适pH，这属于工程。

(4) 农作物秸秆富含纤维素，利用纤维素生产燃料乙醇避免了与人争粮的问题，实现了纤维素类固体废物的减量化、无害化和。

综合题普通

2. 将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。

注：F1-F3、R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；Kan^R表示卡那霉素抗性基因；HygB^R表示潮霉素B抗性基因。

(1) 本操作中获取目的基因的方法是和。

(2) 穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是，驱动目的基因转录。

(3) 根据图中穿梭质粒上的Kan^R和HygB^R两个标记基因的位置，用基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。

(4) 为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是和。

(5) 本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白

综合题普通

3. 幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、胃食管反流病等多种疾病有关。科研人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，通过基因工程制备出相应的疫苗，操作流程如图所示。回答下列问题：

(1) 通过PCR获取Ipp20基因时需要提取幽门螺杆菌的DNA，提取过程中为了将DNA与蛋白质初步分离，使用体积分数为95%的酒精的原理是。在设计一对引物时，在引物序列的端(填“5’”、“3’”或“5’和3’”)中增加两种限制酶的识别序列，便于过程②构建基因表达载体和后续筛选。

(2) 过程③用处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。

(3) 据图分析，培养基A中添加的抗生素是（填“潮霉素”或“氯霉素”），培养基B中添加的抗生素是（填“潮霉素”或“氯霉素”），可用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落（填图中数字）中。

(4) 随着科技的发展，科研人员设计预期的蛋白质结构，利用蛋白质工程研发效果更好、稳定且易保存的新型疫苗成为可能。其中利用氨基酸序列逆推出目的基因中的核苷酸序列，运用的原理为。

综合题普通