将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。注：F1-F3、R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。

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1. 将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。

注：F1-F3、R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；Kan^R表示卡那霉素抗性基因；HygB^R表示潮霉素B抗性基因。

(1) 本操作中获取目的基因的方法是和。

(2) 穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是，驱动目的基因转录。

(3) 根据图中穿梭质粒上的Kan^R和HygB^R两个标记基因的位置，用基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。

(4) 为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是和。

(5) 本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白

【考点】

蛋白质工程; 基因工程的操作程序（详细）;

【答案】

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综合题普通

1. 凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，研究人员利用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中并使之表达。如图表示EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ三种限制酶在质粒和含凝乳酶基因的外源DNA片段上的切割位点．回答下列问题：

（1）根据图中EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ三种限制酶的切割位点分析，该工程中最不适宜用来切割外源DNA获取目的基因的限制酶是，将切割后的质粒和目的基因连接起来需要酶．构建好的重组质粒在目的基因前要加上特殊的启动子，它是识别和结合的部位。

（2）工业化生产过程中，若采用重组大肠杆菌生产凝乳酶，该过程中将目的基因导入大肠杆菌前，常常用处理细胞，使之处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态，这种细胞称为细胞。

（3）研究发现，如果将该凝乳酶第20位和第24位氨基酸改变为半胱氨酸，其催化能力将提高2倍。科学家可以生产上述高效凝乳酶的现代生物工程技术是。该生物工程技术对蛋白质结构的设计和改造，必须通过基因来完成，原因是。

综合题普通

2. 幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、胃食管反流病等多种疾病有关。科研人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，通过基因工程制备出相应的疫苗，操作流程如图所示。回答下列问题：

(1) 通过PCR获取Ipp20基因时需要提取幽门螺杆菌的DNA，提取过程中为了将DNA与蛋白质初步分离，使用体积分数为95%的酒精的原理是。在设计一对引物时，在引物序列的端(填“5’”、“3’”或“5’和3’”)中增加两种限制酶的识别序列，便于过程②构建基因表达载体和后续筛选。

(2) 过程③用处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。

(3) 据图分析，培养基A中添加的抗生素是（填“潮霉素”或“氯霉素”），培养基B中添加的抗生素是（填“潮霉素”或“氯霉素”），可用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落（填图中数字）中。

(4) 随着科技的发展，科研人员设计预期的蛋白质结构，利用蛋白质工程研发效果更好、稳定且易保存的新型疫苗成为可能。其中利用氨基酸序列逆推出目的基因中的核苷酸序列，运用的原理为。

综合题普通

3. 转基因生物培育成功的关键是保证目的基因在受体中的正常表达或抑制特定基因的表达。在这个过程中，根据获得的目的基因不同、采取的措施不同等，培育时选择的方法也不相同。回答下列相关问题：

（1）利用乳腺生物反应器获得胰岛素的过程中，为保证通过反转录法获得的胰岛素基因能正常表达，在构建基因表达载体时需将获得的含目的基因的片段连接在之间，然后通过的方法将基因表达载体导入中。

（2）为降低耐除草剂转基因水稻通过花粉传播而引起的环境生物安全问题，一是利用转入的耐除草剂基因的位置进行控制，如；二是将耐除草剂基因拆分为两部分，只有两部分片段同时存在才具有耐除草剂的特性，请提出可行的措施：。

（3）下图中插入颠倒的转录区的目的是，其原理可能是颠倒的转录区与转录区形成的RNA通过原则形成双链而无法使转录区形成的RNA与核糖体结合。

综合题困难