金属硫蛋白（MT）属于重金属结合蛋白，能够吸收土壤中的镉，蚯蚓的体内富含 MT，可通过基因工程技术将蚯蚓 MT 基因转入烟草中，使烟草获得结合重金属的能力。回答下列问题：（1）获取 MT 基因：从蚯蚓组织中提取 mRNA，用于构建文库。（2）构建基因表达载体：用两种不同限制酶切割质粒与目的基因的目的是（答出1 点即可）。（3）导入受体细胞：烟草为双子叶植物，科研人员常用法将基因表达载体导入受体细胞，利用该方法可使目的基因在受体细胞中得以稳定维持和表达的机制是。（4）目的基因的鉴定：个体水平对目的基因是否翻译出具有功能的蛋白质进行鉴定的方法是。（5）利用转基因烟草修复重金属镉污染土壤的优点有（答出 2 点即可）。

1. 转基因生物培育成功的关键是保证目的基因在受体中的正常表达或抑制特定基因的表达。在这个过程中，根据获得的目的基因不同、采取的措施不同等，培育时选择的方法也不相同。回答下列相关问题：

（1）利用乳腺生物反应器获得胰岛素的过程中，为保证通过反转录法获得的胰岛素基因能正常表达，在构建基因表达载体时需将获得的含目的基因的片段连接在之间，然后通过的方法将基因表达载体导入中。

（2）为降低耐除草剂转基因水稻通过花粉传播而引起的环境生物安全问题，一是利用转入的耐除草剂基因的位置进行控制，如；二是将耐除草剂基因拆分为两部分，只有两部分片段同时存在才具有耐除草剂的特性，请提出可行的措施：。

（3）下图中插入颠倒的转录区的目的是，其原理可能是颠倒的转录区与转录区形成的RNA通过原则形成双链而无法使转录区形成的RNA与核糖体结合。

综合题困难

2. 为更好地利用农杆菌转化玉米，科学家将基因编辑系统引入农杆菌Ti质粒对其进行改造。

(1) Ti质粒在基因工程中常作为。改造后的Ti质粒的部分序列如图1所示，转入玉米细胞后，gRNA能够与玉米细胞DNA特定位点结合，从而引导Cas9蛋白在此位点切断键断开DNA．HR1和HR2与玉米DNA切断位点上下游序列同源，玉米细胞能以同源序列之间的序列为模板合成一段DNA，连接断开的DNA分子，实现外源片段插入。图1中插入玉米染色体的片段能稳定表达和扩增，其他区域的基因只能瞬时表达且无法扩增。在转化玉米的过程中，使用改造后的Tⅰ质粒的优点是。

注：HRA为抗除草剂基因：NPTⅡ为卡那霉素抗性基因

(2) 用上述改造后的农杆菌转化玉米幼胚，在培养基中加入除草剂或均能筛选出已发生转化的幼胚。对培养后的植株进行PCR（引物设计如图2），部分植株实验结果如图3。

电泳结果显示号玉米中成功插入了外源基因，自交后（选填“会”或“不会”）发生性状分离。

(3) 标记基因插入转基因作物染色体中往往会影响植物的生长发育，并带来环境安全隐患。现要制备转耐寒CXE-20基因的转基因玉米，请利用该方法设计Ti质粒相关序列，选择相关基因的序号填入Ti质粒部分序列示意图。

①Cas9 ②gRNA ③HRA ④NPTⅡ ⑤CXE-20 ⑥HR1 ⑦HR2

综合题普通

3. 大肠杆菌一般是将葡萄糖作为碳元素的来源。但是当环境中没有葡萄糖而有乳糖时，大肠杆菌的基因就会迅速表达出与乳糖代谢有关的3种酶：一种是β—半乳糖苷透过酶，它促使乳糖通过细胞膜进入细胞；另一种是β—半乳糖苷酶，催化乳糖水解成半乳糖和葡萄糖；第三种是β—半乳糖苷转乙酰基酶。在这3种酶的作用下，大肠杆菌就能够将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖并加以利用。而当大肠杆菌生活的环境中没有乳糖时，大肠杆菌的基因就不会表达出有关酶。过程见下图所示，请回答有关问题。

(1) 终止子是，其位于结构基因的。

(2) 大肠杆菌的P_R启动子（选填“属于”或“不属于”）诱导型启动子，理由是。

(3) 大肠杆菌中，Z、Y和A基因转录形成的是（选填“1条”“2条”或“3条”）mRNA，依据是。

(4) 当环境中存在乳糖时，大肠杆菌的乳糖操纵子的调节机制可维持细胞中结构基因表达产物水平的相对稳定，此过程属于（选填“正反馈”或“负反馈”）调节，理由是。

综合题困难

1. 乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如下图所示。下列关于该过程的分析不合理的是（）

A. 转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性 B. 可以利用PCR技术筛选含有L-PG基因的受体细胞 C. 通过同源重组实现酵母菌的PD基因被替换为L-PG基因 D. 标记基因Amp^r可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株

单选题普通

2. 噬菌体展示技术（如下图）可将某些蛋白质呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定。以下对该技术的分析错误的是（　　）

A. 建立噬菌体展示库需限制性核酸内切酶和DNA连接酶 B. 可利用抗原抗体杂交技术筛选目标蛋白 C. 用含有碳源、氮源等营养物质的液体培养基扩大培养噬菌体 D. 该技术可用于获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因

单选题普通

3. 下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是（）

A. 将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法 B. 将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌 C. 将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌 D. 目的基因成功导入的标志是受体细胞能产生出人的生长激素

单选题普通

1. 苹果生长过程中易受真菌感染，科研人员将在其他植物中发现的BG2基因转入苹果中，该基因控制合成的β-1，3葡聚糖酶可降解许多病原真菌的细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。请回答下列问题：

(1) 利用PCR技术克隆BG2基因时，应选择下图中的引物（填序号），引物的作用是。

(2) 下图为构建含BG2基因重组质粒的过程。研究人员用XbaⅠ和NotⅠ切割质粒，用NotⅠ和SpeⅠ切割目的基因后，二者可连接在一起构成重组质粒，原因是。若BG2基因两端没有NotⅠ识别序列，PCR时可在引物（填序号）的（填“3”或“5”）端加上NotⅠ识别序列。图中增强子是一段能使基因转录频率明显增加的DNA序列，其参与构成的复合启动子的作用是：①，②增强转录活性。

(3) GUS基因为常用的报告基因，只能在导入真核细胞后正确表达，而在农杆菌中不能正确表达。转GUS基因的植物组织浸泡在含有某底物的营养液中，GUS能与底物发生反应使营养液呈现蓝色。将构建好的BG2重组质粒与经Ca²⁺处理后的农杆菌共培养，然后将菌液接种至含的培养基上可筛选出含有BG2重组质粒的农杆菌，再将其与苹果外植体共培养进行转化，通过（写出筛选过程），从而获得成功转化的受体细胞。

综合题普通

2. 为探究藏系绵羊种欧拉羊的一对相对性状长绒和短绒的遗传规律，并揭示其在羊毛发育过程中的分子机制，研究人员进行了如下的实验。

(1) 研究人员在野生型的短绒欧拉羊的10号染色体的~1023kb至~1028kb区间设计连续的重叠引物，提取突变体和野生型的进行PCR扩增，结果如图所示。

据图可知分子量较小的扩增产物与点样处的距离较(填“远”或“近”)，推测10号染色体上第对引物对应的调控序列(简称M)是突变体长绒出现的根本原因。

(2) 为了进一步证实突变体的长绒表型与调控序列M密切相关，研究人员利用表型为长绒的突变体与表型为短线的野生型作为亲本进行杂交，统计F₁随机交配后代F₂的表型及比例为长绒：短绒=9：7，然后研究人员对F₂中长绒个体的细胞进行PCR扩增以检测短绒基因在突变型与野生型中的差别，扩增结果显示F₂中长绒个体中完全没有短绒基因的比例为。

(3) 研究人员从野生型和突变体中克隆出不同长度的DNA调控序列M后，运用基因工程技术分别导入到报告基因载体中，并将含有M序列的报告基因载体转染到细胞中，以检测M调控序列对启动子活性的影响，结果如图所示。

因此图中用报告基因的表达量/内参基因的表达量用来衡量的表达水平。实验结果说明突变体的调控序列M影响下游基因的表达，且其作用的发挥与调控序列M插入的有关。与此同时，研究人员还发现在欧拉羊野生型和突变体中，基因ASIC2的表达也会影响欧拉羊短绒的发育，但是检测发现突变体ASIC2蛋白结构与野生型一致。综合上述研究推测突变体长绒表型出现的原因是。

综合题困难

3. 为验证pdx1蛋白是决定胰岛形成的最为关键的蛋白质。科研人员以斑马鱼为模式生物，先获得在胰岛区域特异性表达GFP（绿色荧光蛋白，可在荧光显微镜下观察到绿色荧光）的转基因斑马鱼（G品系斑马鱼）。特异性敲除G品系斑马鱼的pdx1基因，获得N品系斑马鱼。回答下列问题：

(1) 制备G品系斑马鱼。

①获得GFP基因。方法一：可从库中获得GFP基因的序列信息，再通过人工合成的方法获得。方法二：以含GFP基因的质粒作为进行PCR，扩增得到大量GFP基因。

②制备重组质粒。将基因的启动子和GFP基因相连后，再与质粒相连。

③导入受体细胞。将重组质粒导入斑马鱼的受精卵，选择受精卵为受体细胞的原因是。

④筛选G品系斑马鱼。若在荧光显微镜下观察小鱼的各个器官时发现，表明成功得到G品系斑马鱼。

⑤筛选纯合G品系斑马鱼。鉴定GFP插入的位置，针对插入位点的上下游设计了引物1、2，针对GFP基因自身序列设计了引物3、4，各引物的位置如图1所示。将G品系斑马鱼相互交配，提取不同子代个体的DNA用引物1、2进行PCR并电泳，结果如图2所示。加样孔对应的个体是纯合G品系斑马鱼。若改用引物3、4进行PCR并电泳，加样孔对应的个体是纯合野生型斑马鱼。

(2) 制备N品系斑马鱼。CRISPR-Cas9技术能特异性敲除基因。制备针对pdx1基因的CRISPR-Cas9体系，采用的方法导入G品系斑马鱼的受精卵中。筛选获得了1个pdx1突变品系（N），PCR后进行，得到的序列如下图3所示（图中下划线表示替换，“-”表示缺失1个碱基）。预计突变品系N的pdx1蛋白含个氨基酸。（已知密码子：CCU-脯氨酸；UAA、UGA和UAG为终止密码子）

(3) 结果预测：荧光显微镜下观察N、G品系斑马鱼的荧光情况为。

(4) 分析与讨论：可通过构建pdx1-GFP融合蛋白实现对pdx1基因表达产物的定位。先依据pdx1-GFP融合蛋白的功能推断其氨基酸序列，进一步推断出其序列，再通过基因工程技术获得改造蛋白。这种获得改造蛋白的技术属于。

综合题困难

1. 下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（）

A. 分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列 B. 该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上 C. 若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组 D. 获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异

单选题困难

2. 下列关于基因工程的叙述，正确的是（）

A. 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B. 抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C. 抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D. 已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置

单选题困难

3. 甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F₁ ，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种。以下对相关操作及结果的叙述，错误的是（）

A. 将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞 B. 通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定 C. 调整培养基中植物激素比例获得F₁花粉再生植株 D. 经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体

单选题普通