某污水处理厂欲处理一批含As3+和硝酸盐浓度较高的污水，研究人员通过对肠道微生物的分离与筛选，得到了耐砷的反硝化细菌，它在厌氧条件下能够将硝酸盐还原为N2O和N2。分离耐砷的反硝化细菌具体步骤如下：采集健康人体的新鲜粪便样本。（1）配制培养基以筛选：该培养基中含有适宜浓度的，从而有利于该菌的生长，抑制其他微生物的生长。此种培养基属于培养基。接种：取采集的人体新鲜粪便样品0.3g，接种至该培养基上。（2）耐砷反硝化细菌的分离与纯化：取200～300μL上述培养液，均匀地涂布在已经添加了5mmol/Las3+和10mmol/LNO3-的细菌固体培养基上。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是；涂布完成后，将平板置于温度为37℃的恒温培养箱中培养24h。挑取长势比较良好、形态大小不同的菌落利用平板划线法进行分离纯化，用该种方法进行接种时，接种工具是，该接种工具的灭菌方法是。操作时，在第二次及其以后的划线时，总是从上一次划线的开始划线，目的是。

1.

某污水处理厂欲处理一批含As³⁺和硝酸盐浓度较高的污水，研究人员通过对肠道微生物的分离与筛选，得到了耐砷的反硝化细菌，它在厌氧条件下能够将硝酸盐还原为N₂O和N₂。分离耐砷的反硝化细菌具体步骤如下：

采集健康人体的新鲜粪便样本。

（1）配制培养基以筛选：该培养基中含有适宜浓度的，从而有利于该菌的生长，抑制其他微生物的生长。此种培养基属于培养基。

接种：取采集的人体新鲜粪便样品0.3g，接种至该培养基上。

（2）耐砷反硝化细菌的分离与纯化：取200～300μL上述培养液，均匀地涂布在已经添加了5mmol/Las³⁺和10mmol/LNO₃^-的细菌固体培养基上。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是；涂布完成后，将平板置于温度为37℃的恒温培养箱中培养24h。挑取长势比较良好、形态大小不同的菌落利用平板划线法进行分离纯化，用该种方法进行接种时，接种工具是，该接种工具的灭菌方法是。操作时，在第二次及其以后的划线时，总是从上一次划线的开始划线，目的是。

【考点】

微生物的分离和培养; 培养基概述及其分类;

【答案】

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综合题普通

1. 野生型菌株经过突变后可能失去合成某种营养物质的能力，称为营养缺陷型菌株，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养物质后才能生长。根据其无法合成的物质种类可分为氨基酸缺陷型菌株、维生素缺陷型菌株和碱基缺陷型菌株等。请完成以下获得营养缺陷型菌株的步骤：

诱变处理：用紫外线诱变野生型大肠杆菌；

(1) 选出缺陷型：限量培养法可用于营养缺陷型菌株的检出，其原理是野生型菌株在限量培养基上获取营养物质的能力强于营养缺陷型菌株。从功能上看，限量培养基属于一种培养基。下图甲为经过限量培养后形成的菌落，其中菌落（填“A”或“B”）即为检出的营养缺陷型大肠杆菌菌株。该方法中还需将一个未接种的平板同时放在恒温培养箱中培养，其主要目的是。

(2) 鉴定缺陷型：利用生长图谱法可初步确定检出的营养缺陷型大肠杆菌的类型，即在基本培养基乙的A~E这5个区域中分别添加不同的营养物质，然后用法将检出的营养缺陷型大肠杆菌接种在乙上，若培养一段时间后在乙的BC交界处长出了菌落，则说明该菌株是营养缺陷型菌。

(3) 鉴定缺陷亚型：研究小组用上述方法鉴定了某菌株属于维生素营养缺陷型，为了进一步确定该菌株的具体类型，他们把15种维生素按照不同组合分为5个小组，分别添加与图丙培养基的对应区域，然后接种菌株后培养一段时间。

组别	维生素组合
1	维生素A	维生素B₁	维生素B₂	维生素B₆	维生素B₁₂
2	维生素C	维生素B₁	维生素D₂	维生素E	烟酰胺
3	叶酸	维生素B₂	维生素D₂	胆碱	泛酸钙
4	对氨基苯甲酸	维生素B₆	维生素E	胆碱	肌醇
5	生物素	维生素B₁₂	烟酰胺	泛酸钙	肌醇

若观察到区域1和区域2产生菌落，则该营养缺陷型大肠杆菌不能合成的维生素是；若菌株为叶酸和生物素的双营养缺陷型大肠杆菌，则其在丙培养基上形成菌落的位置是。

综合题普通

2. 有报道，解钾和解磷微生物可以分解土壤中难溶性的钾和磷，提高土壤可溶性钾和磷的含量。现从某“样地”称取10g供试土壤，先将土壤浸出液梯度稀释，然后吸取3μL菌液接种（第一次）在特定培养基上，根据解钾和解磷水解圈大小筛选出C8和B4两种菌株。将筛选出的两种菌株接种（第二次）在相应培养基并检测培养基中可溶性钾和磷的含量，结果如下表，请回答下列问题：

菌株编号	可溶性钾含量（μg﹒mL^-1）	可溶性无机磷含量（μg﹒mL^-1）	可溶性有机磷含量（μg﹒mL^-1）
C8	27.37	10.27	26.31
B4	0	0	29.38

(1) 取供试土壤时，应从的环境中取土样；筛选解钾和解磷的培养基中需要有（答出4种即可）等营养物质。

(2) 第一次接种的方法为，该方法也可用来统计样品中的活菌数，其原理是。计数时，应选择菌落数为之间的平板进行统计。

(3) 依表格信息，应选（填“C8”或“B4”）作为可高效解钾和解磷的菌种，选择该菌种的理由是。

综合题普通

3. 从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤是：釆集菌样→富集培养—纯种分离→性能测定。请回答以下问题：

(1) 获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌样应从环境釆集。

(2) 对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择以为唯一碳源的培养基，并在条件下培养。

(3) 如图是釆用两种接种方法接种后纯化培养的效果图解，请分析：获得图A效果的接种方法是，获得图B效果的接种方法是。

(4) 配制培养基时各种成分在溶化后倒平板前必须进行；接种时为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在附近进行；培养时，将平板，放入培养箱中。

综合题普通