构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌是解决能源危机的手段之一,思路如下。
Ⅰ.目的基因的选择与获取纤维素降解途径如下
![](https://math.21cnjy.com/MathMLToImage?mml=%3Cmath+xmlns%3D%22http%3A%2F%2Fwww.w3.org%2F1998%2FMath%2FMathML%22%3E%3Cmrow%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E7%BA%A4%3C%2Fmi%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E7%BB%B4%3C%2Fmi%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E7%B4%A0%3C%2Fmi%3E%3Cmn%3E%E2%85%A0%3C%2Fmn%3E%3Cmover%3E%3Cmo%3E%E2%86%92%3C%2Fmo%3E%3Cmrow%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E9%85%B6%3C%2Fmi%3E%3Cmn%3E%E2%85%A0%3C%2Fmn%3E%3C%2Fmrow%3E%3C%2Fmover%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E5%AF%A1%3C%2Fmi%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E7%B3%96%3C%2Fmi%3E%3Cmover%3E%3Cmo%3E%E2%86%92%3C%2Fmo%3E%3Cmrow%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E9%85%B6%3C%2Fmi%3E%3Cmn%3E%E2%85%A1%3C%2Fmn%3E%3C%2Fmrow%3E%3C%2Fmover%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E7%BA%A4%3C%2Fmi%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E7%BB%B4%3C%2Fmi%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E7%B4%A0%3C%2Fmi%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E4%BA%8C%3C%2Fmi%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E7%B3%96%3C%2Fmi%3E%3Cmover%3E%3Cmo%3E%E2%86%92%3C%2Fmo%3E%3Cmrow%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E9%85%B6%3C%2Fmi%3E%3Cmn%3E%E2%85%A2%3C%2Fmn%3E%3C%2Fmrow%3E%3C%2Fmover%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E8%91%A1%3C%2Fmi%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E8%90%84%3C%2Fmi%3E%3Cmi+mathvariant%3D%22normal%22%3E%E7%B3%96%3C%2Fmi%3E%3C%2Fmrow%3E%3C%2Fmath%3E)
(1)提取总RNA经得到cDNA,需在催化下,在引物的端进行DNA链的延伸,得到上图中三种酶的基因,转入酿酒酵母中,其表达产物在细胞(填“内”或“外”)发挥作用。
Ⅱ.目的基因的整合方法
同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因整合到染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株,如图1所示。
![](http://tikupic.21cnjy.com/ct20241o/49/f6/49f6af79a63ebcc43200cff07d61c0a4.png)
注:图1中PCR产物3'端在酶的作用下会多一个“A”碱基
(2)酿酒酵母基因组中rDNA有100-200个重复单元,使用重复序列作为同源重组位点的优点是。
(3)以酶Ⅰ基因为例构建基因表达载体的过程如图1,由图推测,T4DNA聚合酶的作用是,此方法构建基因表达载体的优点是。
(4)图1中空白处“?”应使用酶将构建好的基因表达载体线性化处理,转入酵母菌进行整合。
Ⅲ.标记基因的选择
URA3是尿嘧啶合成关键酶基因,常被用作标记基因。另外,URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。
(5)为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组rDNA内部,并利用的培养基筛选存活菌株。
(6)在后续插入酶Ⅱ基因时,为继续利用URA3作为筛选标记,需切除菌株1的URA3。为此需改进表达载体,还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段loxP(如图2),该序列由反向重复序列和间隔序列组成(如图2),决定其方向的是,该序列以下图方式排列才能通过同源重组达到上述目的。
![](http://tikupic.21cnjy.com/ct20241o/60/42/60428ca6164b4de1228f4d46ac4ac3bc.png)
(7)此后,需要将菌株1在的培养基上培养,存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1'。