高粱等植物的秸秆中含有丰富的半纤维素（主要水解产物是木糖），可以用作燃料乙醇生产的原材料。野生型酿酒酵母是用作乙醇发酵的重要菌种，但因其缺乏专一性的木糖代谢酶，故不能直接利用木糖进行乙醇发酵。研究人员通过基因工程手段让酵母细胞表达木糖转运体，并将木糖代谢相关的XR酶和XDH酶的基因导入野生型酿酒酵母中，筛选出如图甲（URA3基因是尿嘧啶合成基因）的工程菌a，在工程菌a细胞内建立起了木糖代谢的通路，如图乙所示。

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1. 高粱等植物的秸秆中含有丰富的半纤维素（主要水解产物是木糖），可以用作燃料乙醇生产的原材料。野生型酿酒酵母是用作乙醇发酵的重要菌种，但因其缺乏专一性的木糖代谢酶，故不能直接利用木糖进行乙醇发酵。研究人员通过基因工程手段让酵母细胞表达木糖转运体，并将木糖代谢相关的XR酶和XDH酶的基因导入野生型酿酒酵母中，筛选出如图甲（URA3基因是尿嘧啶合成基因）的工程菌a，在工程菌a细胞内建立起了木糖代谢的通路，如图乙所示。

(1) 在合适的发酵条件下发现，工程菌a相对于野生型酿酒酵母对于木糖的利用效率并未得到显著的改善，结合图乙和所学知识，试分析可能原因：（答2点）。

(2) 在上述问题解决后，为了进一步提高乙醇的产量，研究人员利用基因工程技术将能表达XK酶的XK基因与高效启动子相连，导入野生型酵母中，按下图所示技术路线筛选出工程菌b，其中A~D代表PCR扩增引物，LEU2基因是亮氨酸合成基因。

①为了使XK基因与载体质粒正确有效连接，可以通过PCR技术在XK基因的上、下游分别引入（在图中选择相应的限制性内切酶填入）的识别序列，设计的扩增引物位置是图中的（选填大写字母）。

②选择以上所有过程所涉及到的物质填空：筛选获得工程菌a的培养基应使用为唯一碳源，并且不能添加；制备工程菌b需要导入重组质粒a和重组质粒b到受体细胞，该受体细胞应为合成缺陷型酿酒酵母。

(3) 如下表是工程菌a和工程菌b在同等适宜条件下分别进行木糖发酵实验的部分产物检测结果。

	木糖利用g/L	木糖醇产量g/L	乙醇产量g/L
工程菌a	5.6	4.8	6.9
工程菌b	12.4	0.7	9.4

结合图和表中数据，分析工程菌b比工程菌a乙醇产量高的原因：。

【考点】

基因工程的操作程序（详细）;

【答案】

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实验探究题困难

1. 番木瓜很容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，科学家经过精心设计，利用基因工程培育出转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。回答下列问题：

(1) 番木瓜环斑病毒属于单链RNA病毒，科学家首先使用酶将其转化为DNA，从该反应混合液中提取DNA并进行鉴定，鉴定试剂为。

(2) 对提取到的番木瓜环斑病毒DNA中病毒复制基因片段进行PCR扩增，PCR扩增需要选用的引物对为（用图中①~④回答）。PCR结束后的产物常采用（填技术手段）来鉴定。

(3) 科学家设想该基因进入番木瓜后可转录出一段RNA，其与病毒RNA中的复制基因碱基互补配对，从而阻止病毒RNA的复制。若A链为以病毒单链RNA合成的第一步产物，则构建基因表达载体前应将特异性启动子插入图示病毒基因的（填“左侧”或“右侧”）。

(4) 番木瓜属于双子叶植物，则构建好的基因表达载体常采用法进行转化，转化后需在个体水平进行鉴定，请写出简要的鉴定思路：。

实验探究题普通

2. 我国玉米的生产一直受到虫害的严重影响，其中鳞翅目害虫亚洲玉米螟对我国玉米生产的危害较为显著。通过基因工程育种，将抗虫基因crylAb13转入玉米，能够显著提高玉米对玉米螟的抗性。过程如图1所示，其中基因Bar为抗除草剂基因。回答下列问题：

(1) 根据基因表达载体的结构推测，抗除草剂基因Bar的作用是。基因crylAb13必须插入Ti质粒的T-DNA中，原因是。

(2) 获得重组表达载体时，利用限制酶将表达载体线性化。过程①利用技术获取基因crylAb13，然后将线性化的表达载体和基因crylAb13连接。

(3) 过程③利用构建好的重组表达载体转化经处理过的农杆菌，然后侵染玉米愈伤组织，进而获得转基因玉米植株。研究人员探究了农杆菌浓度对基因转化效率的影响，结果如图3所示。实验结果表明，转化效率较高的农杆菌浓度范围为OD600．为了进一步对侵染条件进行优化，可进行实验探究的课题是。

实验探究题普通

3. 葡萄糖二酸（GA）可作为原料应用于食品、能源和医药等领域，科研人员通过改造工程菌以实现GA的大量生产。

(1) M酶和U酶是GA合成途径中的两个关键酶，科研人员将图1所示质粒1导入处理的大肠杆菌，改造后的大肠杆菌可合成GA.

(2) 为实现对工程菌合成GA的实时监测，科研人员设计了质粒2.并进行下表所示两种检测方案。

方案一	质粒1和2共同导入大肠杆菌菌株E中	在液体培养基中培养一段时间	菌液分为5组	每组上清液加入适量GA，检测荧光强度。
方案二	质粒1和2分别导入大肠杆菌菌株E和菌株S中	在液体培养基中培养一段时间	将E菌液与S菌液混合，混合菌液培养一段时间后分为5组	每组上清液加入适量GA，检测荧光强度。

①据图1分析检测方案的原理为。

②检测结果如图2，据图对比两种方案，并结合两种质粒适用范围，选择其中一种更优方案并说明理由：。

(3) 进一步发现由于产物GA呈酸性影响了大肠杆菌合成GA的能力，因而科研人员尝试以酵母菌为受体细胞导入质粒1，改造后的酵母菌以葡萄糖为原料合成并分泌GA的途径如图3.但M酶的活性远小于U酶，限制了GA产量。为改进M酶的催化效率，将含不同突变的M酶基因分别导入酵母菌，利用上述所选方案菌株监测不同酵母菌的GA产量，操作为，取等量培养液，测定其荧光值和吸光度（反应菌体浑浊程度），挑选高的菌株即为GA高产菌株。

(4) 据图3分析还可以通过等方法改造酵母菌以提高GA的产量。

实验探究题困难

分步实验目标	简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向）	①选择图Ⅱ引物； ②PCR目的产物约为bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列	③质粒测序，图Ⅲ中正确的是（选填序列编号）
检测融合蛋白定位	④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明。