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1. 人体内的t-PA蛋白能降解由血纤维蛋白凝聚而形成的血栓。若给心梗患者注射t-PA蛋白，因与血纤维蛋白结合的特异性低，会诱发颅内出血。将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的t-PA 改良蛋白，显著降低出血的副作用。改良过程如图，回答下列问题：

   

(1) 重叠延伸时，提供引物的作用是，以获取t-PA改良基因。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因。
(2) 据图，质粒pCLY11用限制酶切开，改变启动子序列，可以影响重组质粒的效率。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是。
(3) mlacZ表达产物会分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的表型是。
【考点】
PCR技术的基本操作和应用; 基因工程的操作程序（详细）;
【答案】

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1. 人们所需要的大部分核酸的碱基对数量远远超过DNA合成仪可以合成的最长核酸链的碱基对数量，而这种大片段基因的人工合成则可以利用重叠延伸PCR的方法（合成过程如图所示）。据图分析回答下列问题。

(1) 利用重叠延伸PCR人工合成大片段基因，首先需要设计n条单链寡核苷酸片段作为引物（如图中P1~P15），合成这些引物的前提是已知。根据图示分析，相邻近的每2条引物之间均有15~25bp的序列，若第1轮循环需要加入引物P6~P9 ， 请在下图中标注出每个引物的位置。
(2) 第1轮循环（填“需要”或“不需要”）添加模板；第2轮循环选择Px和Py分别对应引物。图示多轮循环（填“能”或“不能”）在同一个PCR体系中完成，原因是。
(3) 利用重叠延伸PCR人工合成大片段基因相对于普通PCR还需要用到酶；结合上述内容分析利用该技术合成基因的优势有。
综合题 普通
2. 非洲猪瘟病毒（ASFV）可感染家猪及野猪，病死率高达100%。抗原蛋白的选择和单克隆抗体的制备是相关疫苗研发的基础。CP312R是ASFV中最具免疫原性的蛋白之一。我国学者利用基因工程和细胞融合技术，成功制备了CP312R蛋白和相应单克隆抗体。

请回答：

(1) 获取目的基因。通过访问互联网，检索获得CP312R蛋白基因序列，采用法合成目的基因。
(2) 设计引物与扩增目的基因。

根据目的基因序列，设计和合成引物。据下表分析，引物1、引物2上分别添加了、限制酶识别序列。

限制酶及识别序列

引物名称及序列（5'+3'）

EcoRI

5'GAATTC3'

引物1：CTAGTCTAGAATGACTACCCACATCTTCCACCCTG

PstI

5'CTGCAG3'

引物2：AAACTGCAGTTAGTGGTGATGGTGGT

GGTGGTGGTGAGCGATAGCGATTTG

XbaI

5'TCTAGA3'

PCR扩增时，应选耐高温的聚合酶。

A．以DNA为模板的RNA                    B．以RNA为模板的RNA

C．以DNA为模板的DNA                    D．以RNA为模板的DNA
(3) 重组质粒的构建与鉴定。

经两种限制酶切割后的目的基因和质粒在DNA连接酶的作用下通过键连接起来，能正确表示这个过程的图像是（填写序号）。

重组质粒经双酶切、电泳分离后，若电泳结果出现个条带表明重组质粒构建成功。电泳时，琼脂糖凝胶作为介质起到的作用，起到电泳指示剂的作用。若电泳时指示剂过早迁移出凝胶，下列调整措施合理有哪些?。

A．调整电泳的时间                           

B．调整指示剂上样量

C．调整加样孔朝向正极                    

D．调整电泳仪电压和温度

E．调整凝胶中琼脂糖的浓度
(4) CP312R蛋白与单克隆抗体的制备。

利用基因工程制备的CP312R蛋白作为，刺激小鼠使其发生免疫反应；诱导从小鼠脾脏分离的与骨髓瘤细胞融合；融合得到的杂交瘤细胞必需经过和，才能获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。与体外培养获得单克隆抗体相比，从小鼠腹水中提取单抗的优点是。（答出2点即可）
综合题 困难
3.  下图1是QuickChange定点突变技术及副反应的示意图，其中的F和R代表引物，其上含有突变的碱基序列。请回答下列问题。

(1) 图中PCR反应体系进行时，除需要加入引物F和引物R、原始质粒、缓冲液外，还需加入的物质有。
(2) 已知DpnI酶是一种限制酶，能特异性识别腺嘌呤甲基化的GATC序列。由图可知，在原始质粒上有（选填“0”“1”或“很多”）个DpnI酶的切割位点。为成功获得带缺刻突变质粒，应对来自大肠杆菌的原始质粒进行的处理是。
(3) 图中的DH5a细胞是处于的大肠杆菌，对带缺刻突变质粒进行修复时需要添加酶。图中副反应发生的原因是新链退火时，两条新链互补配对，互为复制的，扩增出非目的片段。该技术除了图示副反应外，还存在的不足是。
(4) 研究人员对QuickChange定点突变技术进行了改进，在两个PCR体系中分别加入单引物F或R，具体过程下图2。

①单引物PCR1过程中，假设原始质粒有n个，每循环一次产生个双链DNA，循环30次需要个引物F。

②与QuickChange定点突变技术相比，单引物PCR除了能解决第（3）问中的不足，还存在的优点是
综合题 困难