木质素是一类复杂的有机聚合物，在维管植物和一些藻类的支持组织中起着重要的结构作用，在细胞壁的形成中特别重要，特别是在木材和树皮中，因为这些部分富含木质素，从而赋予它们刚性并且不容易腐烂的特性。科研团队尝试从木材场土壤中筛选分离出木质素分解菌，实验流程如下图所示。请回答下列问题：

1. 木质素是一类复杂的有机聚合物，在维管植物和一些藻类的支持组织中起着重要的结构作用，在细胞壁的形成中特别重要，特别是在木材和树皮中，因为这些部分富含木质素，从而赋予它们刚性并且不容易腐烂的特性。科研团队尝试从木材场土壤中筛选分离出木质素分解菌，实验流程如下图所示。请回答下列问题：

(1) 用于培养微生物的培养基可以为微生物提供的营养物质主要有。实验时，一般对配制的培养基采用法进行灭菌，对培养皿、烧瓶及吸管等玻璃器皿一般用法灭菌。

(2) 若每个环节的稀释倍数与步骤②的稀释倍数相同，则步骤④试管内的无菌水是mL。图示操作过程中，共将1g土壤稀释了倍。实验过程中，纯化细菌的关键是无菌操作和。

(3) ⑤纯化培养过程中所采用的接种方法是，在五个固体培养基上分别接种0.1mL该菌菌液，适宜条件下培养一段时间后，若培养基上的菌落数分别为：28、70、144、139、131，则每克土壤样品中该菌的数量约为个。

【考点】

微生物的分离和培养; 组织培养基的成分及作用; 灭菌技术; 其他微生物的分离与计数;

【答案】

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实验探究题普通

1. VC的传统生产方法是莱氏化学法，这种方法工序复杂、效率低而且伴有大量有毒气体和废弃物的产生。我国发明了二步混菌发酵法生产VC前提。二步混菌发酵法的第一步是利用生黑醋酸杆菌发酵（培养液pH=4~5），第二步是经氧化葡萄糖酸杆菌和假单胞杆菌混合发酵（培养液pH-6.0~7.5），最终将葡萄糖转化为VC前体，然后经内酯化等步骤，VC前提可转化为VC，这种生产VC的方法工序简单，收率高，成本低，安全，对环境污染小。目前，我国发明的二步混菌发酵生产VC的工艺处子世界领先水平。回答下列问题：

(1) 人们按照微生物对的不同需求配制培养基。培养基一般都含有等物质。

(2) 实验室及生产中进行微生物分离和纯化的常用方法是和稀释涂布平板法。稀释涂布平板法还可用于微生物的计数，在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是。

(3) 对第一步发酵培养液检测发现几乎没有杂菌存在，推测最可能的原因是。在第二步发酵中区分氧化葡萄糖酸杆菌和假单胞杆菌的方法是，在进行发酵生产时，废弃培养液不能直接排放到外界环境中，原因是。

实验探究题普通

2. 西花蓟马是一种对农作物危害性极大的害虫，球孢白僵菌是一种常见的虫生真菌。为了获得对西花蓟马高毒力、产孢子（该菌的繁殖体）能力强，且在继代培养过程中毒性较稳定的球孢白僵菌菌株，某研究小组开展了有关实验。回答下列问题：

(1) 欲获得球孢白僵菌，可从体内寻找，再通过毒性实验筛选出对西花蓟马高毒力的菌株。

(2) 将（1）中筛选得到的菌株，接种到CMA培养基（玉米粉20g·L^-1、麦麸10g·L^-1、蛋白胨5g·L^-1、KH₂PO₄3g·L^-1、NH₄NO₃1g·L^-1、MgSO₄·7H₂O 1g·L^-1、琼脂15g·L^-1）上，可筛选出毒力高、产孢子能力强的菌株。该过程中常用的接种方法有。

(3) 从物理性质上看，CMA培养基属于，该培养基中为球孢白僵菌提供碳源的成分有。通常，制备培养基时要根据所培养的微生物种类不同来调节培养基的pH，其原因是。

(4) 为筛选出在继代培养过程中能使球抱白佩菌毒性较稳定的培养基，研究小组将（2）中筛选得到的菌株分别接种到3种培养基CMA、CMA +蝉蜕粉、CMA +西花蓟马尸粉）中，进行继代培养，用各代菌株分别处理西花蓟马，并统计其死亡率，结果如下表。

培养代数	第5天的校正累积死亡率（%）
培养代数	CMA培养基	CMA+蝉蜕粉	CMA+西花蓟马尸粉培养基
1	93.62	89.36	93.62
2	89.36	91.49	93.62
3	74.47	93.62	93.62
4	78.72	93.62	97.87
5	65.96	87.23	93.62

分析表中结果，可得出的结论是。为长期保存筛选得到的球孢白低菌优良菌种，可以采用的方法。

实验探究题普通

3. 回答与高山兀鹫肠道微生物的分离鉴定与耐药性分析有关的问题：

(1) 细菌的分离与纯化。在无菌条件下，将高山兀鹫粪便样本，放入1 mL无菌水中，3000r /min离心5 min。取100μL，在无菌水中进行10倍梯度稀释，制成10^－1至10^－9梯度稀释液。分别吸取其中的不同梯度稀释液接种在LB琼脂和MRS琼脂培养基（乳酸细菌培养基）上。分别在有氧以及培养环境中，37℃培养24-48 h。然后挑取表征（颜色、大小、形状）不同的于LB肉汤和MRS肉汤中，分别在相应培养环境中37℃培养12 h。

(2) 药敏试验。采用药敏纸片琼脂扩散法，将特定的菌液均匀接种在琼脂培养基上，贴上34种药敏纸片。将贴有药敏纸片的培养基，放入培养箱中37℃培养16 h后测量直径，并依据抗菌药物敏感性试验的技术要求判定结果。以大肠埃希氏菌为质控菌株，若质控菌株的正常，则药敏试验的结果可靠。

(3) 当细菌长期处于含抗生素的生存环境时，在作用下，敏感菌株被抑制或杀灭，而天然耐药或获得性耐药菌株则继续生存、繁殖和克隆传播，进一步导致细菌的耐药性。

实验探究题普通