如图为基因工程中所使用的某载体示意图、部分限制酶的识别序列及切割位点。回答下列问题：

1. 如图为基因工程中所使用的某载体示意图、部分限制酶的识别序列及切割位点。回答下列问题：

(1) 基因工程的核心操作是构建基因表达载体，基因表达载体必须具有启动子、终止子、目的基因、等，其中目的基因应位于之间；在构建基因表达载体时，应选择图中两种限制酶切割载体，并用（填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”）连接载体和目的基因。

(2) 利用基因工程技术构建哺乳动物乳腺生物反应器批量生产药物时，应将药用蛋白基因与动物等调控元件重组在一起，通过方法导入哺乳动物的中，培养成转基因动物后，在其泌乳期从乳汁中收集药物。

(3) 基因工程常利用PCR获取和扩增目的基因，引物设计是PCR成功的关键。引物的作用是，其长度通常为20~30个核苷酸，引物序列过长会导致复性温度过高，不利于酶的作用；扩增循环n次共消耗引物种。

【考点】

PCR技术的基本操作和应用; 基因工程的应用; 基因工程的操作程序（详细）;

【答案】

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综合题困难

1. 家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。巢式PCR中的两次PCR使用了2对不同引物，先使用外引物对目标区域DNA片段进行第一次PCR扩增，产生中间产物，然后使用内引物对中间产物进行第二次PCR扩增，产生目标产物。下图是巢式PCR工作原理示意图。回答下列问题：

(1) 巢式PCR反应体系中需要加入的原料是，巢式PCR过程用代替解旋酶，为激活反应体系中的DNA聚合酶，还需要加入。

(2) 相比于常规PCR获得的产物，巢式PCR获得的产物特异性。

(3) 科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上的雄性决定基因（SRY）和常染色体上的酪蛋白基因（CSN1S1），用以进行早期胚胎的性别鉴定，并对鉴定后的胚胎进行移植。

①取囊胚的滋养层细胞提取DNA，原因是。

②根据牛的SRY和CSN1S1基因序列共可设计合成对引物。

③PCR过程：预变性→变性→复性→延伸。

④观察扩增结果：电泳分析。

⑤对符合要求的胚胎进行移植，在操作过程中不需要对受体提供免疫抑制剂，原因是。

综合题困难

2. 巢式聚合酶链式反应（Nested PCR）属于普通PCR的衍生技术，相较于普通PCR，巢式PCR能有效提高产物中目的基因的比例，增加PCR的灵敏度和特异性。巢式PCR通常包括两个连续的扩增反应，每个反应使用不同的一对引物。第一次PCR用一对外引物进行扩增，其产物会被用作第二次PCR的模板，第二次PCR由一对内引物（结合位点位于外引物对结合点的内部）扩增目的基因，过程如下图所示。

(1) 巢式PCR反应体系所需的试剂如下，请补齐空白处：

PCR反应缓冲液（含有MgCl₂）

dNTP混合液（所有四种dNTP，即dATP、dTTP、dCTP、dGTP）

引物：内引物1，内引物2，外引物1，外引物2

模板 DNA

H₂O

其中 PCR反应缓冲液中Mg²⁺的作用是，相比直接使用4种脱氧核苷酸，在反应体系中加入dNTP的优势有。

(2) 与普通PCR相比巢式PCR中设计的引物只是在模板DNA的结合位置有所差异。进行巢式PCR前，根据已知的模板DNA序列，可设计合成内外引物对，引物设计的要求有（答出两点即可）；同时，为方便扩增产物后续的操作，可在引物的（填“5＇端”或“3＇端”）添加限制性内切核酸酶位点。

(3) 将题（1）中试剂按顺序加入扩增离心管中，按下表参数在PCR仪中进行扩增：

周期数	变性	复性	延伸
1-30	94℃下30s	50℃下30s	72℃下2.5min

在扩增后对PCR的产物进行电泳鉴定时发现出现较多的非特异性条带，此时可适当（填“提高”或“降低”）复性温度来减少非特异性条带，原因是。

(4) 巢式PCR可大大提高扩增特异性的原因是。

综合题普通

3. 非洲猪瘟病毒（ASFV）可感染家猪及野猪，病死率高达100%。抗原蛋白的选择和单克隆抗体的制备是相关疫苗研发的基础。CP312R是ASFV中最具免疫原性的蛋白之一。我国学者利用基因工程和细胞融合技术，成功制备了CP312R蛋白和相应单克隆抗体。

请回答：

(1) 获取目的基因。通过访问互联网，检索获得CP312R蛋白基因序列，采用法合成目的基因。

(2) 设计引物与扩增目的基因。

根据目的基因序列，设计和合成引物。据下表分析，引物1、引物2上分别添加了、限制酶识别序列。

限制酶及识别序列		引物名称及序列（5'+3'）
EcoRI	5'GAATTC3'	引物1：CTAGTCTAGAATGACTACCCACATCTTCCACCCTG
PstI	5'CTGCAG3'
		引物2：AAACTGCAGTTAGTGGTGATGGTGGT GGTGGTGGTGAGCGATAGCGATTTG
XbaI	5'TCTAGA3'

PCR扩增时，应选耐高温的聚合酶。

A．以DNA为模板的RNA B．以RNA为模板的RNA

C．以DNA为模板的DNA D．以RNA为模板的DNA

(3) 重组质粒的构建与鉴定。

经两种限制酶切割后的目的基因和质粒在DNA连接酶的作用下通过键连接起来，能正确表示这个过程的图像是（填写序号）。

重组质粒经双酶切、电泳分离后，若电泳结果出现个条带表明重组质粒构建成功。电泳时，琼脂糖凝胶作为介质起到的作用，起到电泳指示剂的作用。若电泳时指示剂过早迁移出凝胶，下列调整措施合理有哪些?。

A．调整电泳的时间

B．调整指示剂上样量

C．调整加样孔朝向正极

D．调整电泳仪电压和温度

E．调整凝胶中琼脂糖的浓度

(4) CP312R蛋白与单克隆抗体的制备。

利用基因工程制备的CP312R蛋白作为，刺激小鼠使其发生免疫反应；诱导从小鼠脾脏分离的与骨髓瘤细胞融合；融合得到的杂交瘤细胞必需经过和，才能获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。与体外培养获得单克隆抗体相比，从小鼠腹水中提取单抗的优点是。（答出2点即可）

综合题困难