科学家采用了图示流程，将除草剂抗性基因导入到玉米细胞中，以期获得抗除草剂性状的转基因玉米。图中的报告基因含有内含子，不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色；通常利用报告基因来标定目的基因，筛选得到转基因生物。转化过程中常有残留农杆菌附着在愈伤组织表面，进而导致未转化的愈伤组织也可能在含除草剂的培养基中生长，称为假阳性。回答下列问题：

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1. 科学家采用了图示流程，将除草剂抗性基因导入到玉米细胞中，以期获得抗除草剂性状的转基因玉米。图中的报告基因含有内含子，不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色；通常利用报告基因来标定目的基因，筛选得到转基因生物。转化过程中常有残留农杆菌附着在愈伤组织表面，进而导致未转化的愈伤组织也可能在含除草剂的培养基中生长，称为假阳性。回答下列问题：

(1) 获得抗除草剂转基因玉米的过程中核心步骤是，该步骤中使用T4 DNA连接酶相较于E.coliDNA连接酶的优势是。

(2) 图示过程中选用农杆菌，是因其Ti质粒上有一段包含报告基因的T-DNA序列，该片段能，从而使其携带的目的基因的遗传遵循孟德尔遗传定律。为防止酶切产物自身环化，需使用种限制酶，分别对含除草剂抗性基因G的DNA片段和Ti-质粒上的（填“报告基因”“T-DNA”或“氨苄青霉素抗性基因”）进行酶切。

(3) 农杆菌细胞内“报告基因”表达后（填“能”或“不能”）催化无色物质K呈现蓝色，原因是。

(4) 通过在培养基中添加进行“筛选1”，为了排除假阳性干扰，需通过在培养基中添加进行“筛选2”。

【考点】

基因工程的操作程序（详细）;

【答案】

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综合题普通

1. 胰岛素是治疗人类糖尿病的特效药，传统生产胰岛素的方法是从动物胰腺中提取。1978年，我国科学家将人胰岛素基因（S）导入大肠杆菌细胞中，构建基因工程菌并进行筛选，使大肠杆菌表达重组人胰岛素，这是我国拥有自主知识产权的基因工程药物，流程如图所示。为防止目的基因与载体质粒反向连接，选用图中MunI和NheI两种限制酶来切割目的基因和质粒，但INS基因的两侧无MunI和NheI两种限制酶的识别序列及切割位点，可在PCR扩增INS基因时增加MunI和NheI两种限制酶的识别序列，以便构建基因表达载体。回答下列问题：

注：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。图中限制酶识别序列及切割位点：EcoRI：G^↓AATTC、MunI：C^↓AATTG、NheI：G^↓CTAGC、XhoI：C^↓TCGAG

(1) 设计引物时需要在引物的（填“3'”或“5'”）端增加相应限制酶的识别序列。

(2) 已知INS基因编码区首端和末端（其中一条链）的序列为5'-AGCCCTCC…（中间核苷酸序列）…GAACCAGC-3'，下列可选用的一对引物是_____（选填字母序号）。 A. 5'-GAATTCAGCCCTCC-3' B. 5'-CAATTGAGCCCTCC-3' C. 5'-GCTAGCGCTGGTTC-3' D. 5'-CTCGAGGAACCAGC-3'

(3) 流程中步骤③将目的基因导入大肠杆菌前，常用处理大肠杆菌细胞，以提高转化率。

(4) 在经步骤③处理后的大肠杆菌中进一步分离筛选出导入重组质粒（含目的基因的质粒）的大肠杆菌，从菌落特征的角度设计一个实验方案进行筛选，要求写出实验思路及预期结果。

综合题困难

2. 国内牛奶制品因为牧草进口成本上涨而涨价的现象引起了人们的关注。紫花苜蓿是一种重要的牧草，某研究团队拟将耐盐基因HLA1导入紫花苜蓿中培育耐盐牧草，具体实验流程如图甲，图乙是载体pCHLA1中T-DNA示意图，已知Basta是一种除草剂。回答下列问题：

(1) 过程②为，是基因工程的核心步骤，此过程需要使用的酶有；过程③常用的方法是．

(2) 为达到培养并筛选的目的，过程④的培养基除了加入植物生长所需的营养物质外，还需加入。

(3) 过程④得到的幼苗（填“一定”或“一定不”或“不一定”）含有HLA1基因，为进一步确认，可用PCR扩增的方法进行鉴定，进行PCR反应所用到的引物应根据设计。

(4) 要检测目的基因是否插入到苜蓿细胞的染色体DNA上，可采用技术。

(5) 判断本实验的目的基因是否表达成功，还应进行实验。

综合题普通

3. 栽培草莓果实的红色由花青素等天然色素决定。科研人员对花青素代谢和运输过程中F基因的作用机制进行研究。

(1) 科研人员构建含有F基因的重组Ti质粒，如图1。

①构建重组T-DNA片段时，需要用KpnI、酶共同处理，再通过农杆菌转化法将其导入到白色的草莓果肉细胞中。

②Ti质粒上的潮霉素抗性基因的具体作用是。

(2) 研究表明，F3'H基因和ANR基因为花青素合成代谢的重要基因，二者均可由特异性启动子控制表达。为研究F基因的作用机制，科研人员分别构建含有图2所示DNA片段的表达载体。

科研人员分别在1~4组草莓果肉细胞中导入不同表达载体，测定荧光强度，处理及结果如图3。

①实验中，1、3组的作用是。

②图3结果表明。

(3) 基于上述研究，若将F基因转入玫瑰、菊花等观赏花卉中，用以研发色彩绚丽的转基因鲜切花商品，则在生产实践中可能面临的挑战是。

综合题困难

分步实验目标	简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向）	①选择图Ⅱ引物； ②PCR目的产物约为bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列	③质粒测序，图Ⅲ中正确的是（选填序列编号）
检测融合蛋白定位	④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明。