甘薯是一种重要的粮食作物，对低温敏感，极不耐霜冻。当温度低于10℃时，甘薯的储藏性能降低。科研人员欲将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基因TmAFP导入甘薯细胞中培育抗冻甘薯新品种，主要技术路线如图1所示，相关限制酶切割位点如图2所示（箭头表示切割位点）。据图回答问题。

1. 甘薯是一种重要的粮食作物，对低温敏感，极不耐霜冻。当温度低于10℃时，甘薯的储藏性能降低。科研人员欲将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基因TmAFP导入甘薯细胞中培育抗冻甘薯新品种，主要技术路线如图1所示，相关限制酶切割位点如图2所示（箭头表示切割位点）。

据图回答问题。

(1) 若要利用PCR技术获取并克隆TmAFP基因，需要设计种引物，引物的碱基序列不能互补，以免发生。PCR反应中过程所需温度最低。

(2) 图1中①是指，这一步是培育转基因抗冻甘薯的核心工作。为了成功得到重组质粒P₂ ，确保TmAFP基因插入载体中的方向正确，最好选用限制酶切割质粒P₁。

(3) 采用农杆菌转化法将TmAFP基因导入甘薯细胞，农杆菌细胞中T-DNA的作用是。

(4) 图1中⑤和⑥分别为过程，可用技术检测转基因甘薯愈伤组织中是否产生抗冻蛋白。

【考点】

植物组织培养的过程; 基因工程的操作程序（详细）;

【答案】

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综合题普通

1. 红景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，科研人员将红景天中的HMA3基因转入栾树，以实现栾树的定向改良，使其增强对Cd的富集能力，从而更有效治理Cd污染。主要技术流程如下图，请回答：

(1) 重组质粒的构建、扩增、保存。为构建Cd转运蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，需确保目的基因与质粒正确连接。构建重组质粒时用酶（双酶切）切PCR纯化产物（已添加相应酶切位点）及Ti质粒，然后通过DNA连接酶进行连接制备重组质粒，并依次转入大肠杆菌和农杆菌。

(2) 栾树愈伤组织的诱导。切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基，培养基应添加等植物激素，放入培养箱，经过21d的黑暗诱导，茎段经形成愈伤组织。

(3) 农杆菌介导转化体系的建立。用农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化，并用添加的培养基（抗生素）筛选出转化成功的愈伤组织，将愈伤组织继续培养成完整植株。

(4) 目的基因的检测和鉴定。取愈伤组织用纤维素酶和果胶酶处理一段时间获得原生质体，在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。据此可知，在本研究中选择GFP与Cd转运蛋白构建融合蛋白的目的是。若要从个体生物学水平上进行目的基因的检测与鉴定，则可以检测比较转基因栾树与野生型栾树。

综合题普通

2. 研究发现，利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。

(1) 若用限制酶BsaI分别酶切载体和大豆基因L的向导DNA 序列，理论上是否可进行定向连接并说明理由。

(2) 构建的重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，再将大豆细胞经技术培育为植株，从中筛选出转基因植株需选用的抗生素是，原因是。

(3) 为了鉴定基因编辑是否成功，以选出的转基因大豆①~④的DNA 为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙、丙所示，PCR 产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是，其中纯合的突变植株是（填图丙中序号）。为确认该植株是否为耐盐碱大豆品系，还应做的个体水平检测及结果是，即筛选出了耐盐碱大豆，可用于后续的品种选育。

综合题困难

3. 烟草花叶病毒（TMV）能使烟草大幅度减产。某中药植物细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草。

(1) 研究人员首先从中药植物细胞中提取总RNA，通过逆转录过程获得双链cDNA；然后再在Taq酶的催化下进行PCR扩增，将抗TMV基因插入Ti质粒的T－DNA中，用法将重组质粒导入受体细胞。接下来在含有卡那霉素的培养基上培养受体细胞，其目的是。最后，将得到的细胞运用技术培育出再生植株。

(2) 由于上述基因工程中目的基因插入的位点通常具有不确定性，若要检测抗TMV基因所插入染色体的具体位置则可采用反向PCR技术。该技术可以由已知序列的基因扩增出其周围未知的序列从而对基因进行定位。下图是利用这一技术分析抗TMV基因（用基因a表示）所插入染色体位置的流程图。为了保证染色体DNA酶切以后能自我环化，则步骤Ⅰ对限制酶的要求是。若已知基因a的一条单链序列为：5'－GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA－3'（虚线处省略了部分核苷酸序列），则在步骤Ⅲ中选用的两种PCR引物是（填序号）。

①5'－GCGCTCATGA－3' ②5'－CGCGAGTACT－3'

③5'－CGTAGCCTCT－3' ④5'－TACGCATTGC－3'

(3) 结果显示抗病基因插入了两个基因的中间，测序后发现左侧为乙酰－CoA羧化酶基因，右侧为甘油三酯酯酶基因，其中乙酰－CoA羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解过程的关键酶基因。现有两个能使烟草积累油脂的基因LEA和VOC，将它们分别导入此新培育的转基因抗TMV烟草中，培养成转基因植物A、B，分别检测植物体内AC和ATGL基因的表达水平，结果如下图

①在分子水平上，用（技术）检测AC酶和ATGL酶的表达量可得到上述结果。

②基于以上研究，LEA和VOC在烟草油脂积累中的机制是。

综合题普通