巴斯德毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源，不能合成组氨酸。科研人员利用巴斯德毕赤酵母、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、含有组氨酸合成基因的质粒生产转基因重组酵母乙肝疫苗。HBsAg基因上的两个限制酶切割位点如图1所示。请回答下列问题：

1. 巴斯德毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源，不能合成组氨酸。科研人员利用巴斯德毕赤酵母、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、含有组氨酸合成基因的质粒生产转基因重组酵母乙肝疫苗。HBsAg基因上的两个限制酶切割位点如图1所示。请回答下列问题：

(1) 利用PCR技术扩增HBsAg基因的原理是。设计引物是PCR技术中至关重要的一环，图2中，引物Ⅰ、引物Ⅱ中有一个设计不合理，请指出并说明原因：。

(2) 研究人员用限制酶EcoRⅠ切出的末端Ⅰ为

，用限制酶Sma Ⅰ切出的末端Ⅱ为

，请依次写出这两种限制酶的识别序列，并用箭头标出切割位点：、。HBsAg基因转录时以图1中α链为模板链，则插入质粒时，酶切位点（填“1”或“2”）离启动子更近，原因是。

(3) 筛选成功导入重组质粒的巴斯德毕赤酵母并观察菌落的形态，所用培养基的特点为。

【考点】

PCR技术的基本操作和应用; 基因工程的基本工具（详细）; 基因工程的操作程序（详细）;

【答案】

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综合题普通

1. 非洲猪瘟病毒（ASFV）可感染家猪及野猪，病死率高达100%。抗原蛋白的选择和单克隆抗体的制备是相关疫苗研发的基础。CP312R是ASFV中最具免疫原性的蛋白之一。我国学者利用基因工程和细胞融合技术，成功制备了CP312R蛋白和相应单克隆抗体。

请回答：

(1) 获取目的基因。通过访问互联网，检索获得CP312R蛋白基因序列，采用法合成目的基因。

(2) 设计引物与扩增目的基因。

根据目的基因序列，设计和合成引物。据下表分析，引物1、引物2上分别添加了、限制酶识别序列。

限制酶及识别序列		引物名称及序列（5'+3'）
EcoRI	5'GAATTC3'	引物1：CTAGTCTAGAATGACTACCCACATCTTCCACCCTG
PstI	5'CTGCAG3'
		引物2：AAACTGCAGTTAGTGGTGATGGTGGT GGTGGTGGTGAGCGATAGCGATTTG
XbaI	5'TCTAGA3'

PCR扩增时，应选耐高温的聚合酶。

A．以DNA为模板的RNA B．以RNA为模板的RNA

C．以DNA为模板的DNA D．以RNA为模板的DNA

(3) 重组质粒的构建与鉴定。

经两种限制酶切割后的目的基因和质粒在DNA连接酶的作用下通过键连接起来，能正确表示这个过程的图像是（填写序号）。

重组质粒经双酶切、电泳分离后，若电泳结果出现个条带表明重组质粒构建成功。电泳时，琼脂糖凝胶作为介质起到的作用，起到电泳指示剂的作用。若电泳时指示剂过早迁移出凝胶，下列调整措施合理有哪些?。

A．调整电泳的时间

B．调整指示剂上样量

C．调整加样孔朝向正极

D．调整电泳仪电压和温度

E．调整凝胶中琼脂糖的浓度

(4) CP312R蛋白与单克隆抗体的制备。

利用基因工程制备的CP312R蛋白作为，刺激小鼠使其发生免疫反应；诱导从小鼠脾脏分离的与骨髓瘤细胞融合；融合得到的杂交瘤细胞必需经过和，才能获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。与体外培养获得单克隆抗体相比，从小鼠腹水中提取单抗的优点是。（答出2点即可）

综合题困难

2. 人们所需要的大部分核酸的碱基对数量远远超过DNA合成仪可以合成的最长核酸链的碱基对数量，而这种大片段基因的人工合成则可以利用重叠延伸PCR的方法（合成过程如图所示）。据图分析回答下列问题。

(1) 利用重叠延伸PCR人工合成大片段基因，首先需要设计n条单链寡核苷酸片段作为引物（如图中P₁~P₁₅），合成这些引物的前提是已知。根据图示分析，相邻近的每2条引物之间均有15~25bp的序列，若第1轮循环需要加入引物P₆~P₉ ，请在下图中标注出每个引物的位置。

(2) 第1轮循环（填“需要”或“不需要”）添加模板；第2轮循环选择Px和Py分别对应引物。图示多轮循环（填“能”或“不能”）在同一个PCR体系中完成，原因是。

(3) 利用重叠延伸PCR人工合成大片段基因相对于普通PCR还需要用到酶；结合上述内容分析利用该技术合成基因的优势有。

综合题普通

3. 下图1是QuickChange定点突变技术及副反应的示意图，其中的F和R代表引物，其上含有突变的碱基序列。请回答下列问题。

(1) 图中PCR反应体系进行时，除需要加入引物F和引物R、原始质粒、缓冲液外，还需加入的物质有。

(2) 已知DpnI酶是一种限制酶，能特异性识别腺嘌呤甲基化的GATC序列。由图可知，在原始质粒上有（选填“0”“1”或“很多”）个DpnI酶的切割位点。为成功获得带缺刻突变质粒，应对来自大肠杆菌的原始质粒进行的处理是。

(3) 图中的DH5a细胞是处于的大肠杆菌，对带缺刻突变质粒进行修复时需要添加酶。图中副反应发生的原因是新链退火时，两条新链互补配对，互为复制的，扩增出非目的片段。该技术除了图示副反应外，还存在的不足是。

(4) 研究人员对QuickChange定点突变技术进行了改进，在两个PCR体系中分别加入单引物F或R，具体过程下图2。

①单引物PCR1过程中，假设原始质粒有n个，每循环一次产生个双链DNA，循环30次需要个引物F。

②与QuickChange定点突变技术相比，单引物PCR除了能解决第（3）问中的不足，还存在的优点是

综合题困难