如图所示，若在PCR反应体系中加入两侧分别带有荧光基团和淬灭基团（抑制荧光发出）的探针，荧光探针和引物一起与模板结合，当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团和淬灭基团分离而发出荧光（每扩增1个DNA分子，就有1个荧光探针水解），图中①～③表示步骤。回答下列问题：

1. 如图所示，若在PCR反应体系中加入两侧分别带有荧光基团和淬灭基团（抑制荧光发出）的探针，荧光探针和引物一起与模板结合，当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团和淬灭基团分离而发出荧光（每扩增1个DNA分子，就有1个荧光探针水解），图中①～③表示步骤。回答下列问题：

(1) PCR过程包括多次循环，每个循环分为3个步骤：变性、、延伸。延伸的温度一般设定为；若DNA中G+C的含量越多，要求变性的温度越高，其原因是。

(2) PCR过程中引物的作用是。

(3) 在相同PCR循环次数条件下，荧光强度与模板数量（填“不相关”“呈正比”或“呈反比”）。若最初该反应体系中只有1个DNA分子模板，进行第4次循环时，需要消耗荧光探针个。

【考点】

PCR技术的基本操作和应用;

【答案】

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实验探究题普通

1. 干扰素是动物体内的一种糖蛋白，可用于治疗病毒的感染和癌症。中国干扰素之父侯云德院士利用基因工程的方法获得了人干扰素，请回答问题：

(1) 获取干扰素基因的方法之一是从已被病毒免疫的白细胞中提取mRNA，在酶的作用下合成cDNA，再利用PCR技术扩增。PCR反应体系中加入Mg²⁺ ， Mg²⁺的作用是。PCR反应过程中温度最低的步骤是。PCR反应体系中第五轮循环需要消耗引物2的数量是个。

(2) 为了让干扰素基因正确连接到PET-28质粒中，应在引物的(填“5'”或“3'”)端加入限制酶的识别序列。

(3) 人干扰素在体外保存相当困难，研究发现是由于干扰素第17位的半胱氨酸影响了第31位和第141位2个半胱氨酸之间二硫键的稳定，若将第17位的半胱氨酸替换成丝氨酸，可使人干扰素结构稳定，且不影响生理功能。根据上述信息，若要获得在体外能保存较长时间的人干扰素，你的实验思路是。

实验探究题困难

2. 基因工程是培育新品种花卉的一种重要技术手段。研究发现普通矮牵牛花因缺乏蓝色色素合成所需的转座酶而不能开蓝色花，研究人员从蔷薇花瓣细胞中分离提取的转座酶F35H基因转入普通矮牵牛中，获得蓝色矮牵牛新品种。回答下列问题：

(1) 从蓝色矮牵牛花瓣细胞中粗提取DNA时，加入酒精的目的是。对粗提取的DNA进行鉴定时，加入试剂后置于沸水中加热。

(2) 提取蓝色矮牵牛花DNA，获取F35H基因，并PCR扩增，已知F35H基因的两端碱基序列如下：

采用PCR技术扩增该基因，需要使用的引物1序列为5'-TCTGTTGAAT-3'，则引物2的序列为（标出：5'和3'端）。在PCR扩增仪中已加入了一定的缓冲溶液、F35H基因、Mg²⁺、Taq酶、两种引物，还需要加入的物质有。

(3) PCR扩增过程一般由变性、复性和延伸三步经多次循环完成。其中延伸阶段选用72℃而非95℃综合考虑了两个因素：和。

(4) 扩增得到的PCR产物一般先通过对产物进行初步鉴定，如下图。F35H基因的大小约为990bp。结果显示，号样品具有阳性条带，且条带长度符合预期，即为成功导入F35H基因的植株。

实验探究题普通

3. tPA是一种临床上用于治疗心脑血栓类疾病的药物，科研人员计划用动物乳腺生物反应器生产tPA，但tPA并不是乳腺蛋白，因此在动物乳腺中的表达水平较低。生长激素（GH）可促进动物细胞增殖和乳腺生长发育及维持泌乳。研究人员通过构建具有GH基因和IPA基因的双转基因小鼠，探究GH能否促进外源目的基因tPA的表达。回答下列问题：

(1) 为获得转基因小鼠，将tPA基因通过的方法注入小鼠的中，将发育成为tPA单转基因个体；同理将tPA基因和GH基因同时注入获得双转基因小鼠，选择性别为的个体作为后续研究对象。

(2) 剪取转基因小鼠的少量尾尖组织，提取基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入特定的引物，引物的作用是，扩增的产物再经过技术来鉴定是否成功。

(3) 图1是两种基因表达载体的部分示意图，图中CMV代表的启动子。利用PCR技术来检测基因整合情况，若小鼠成功整合了tPA基因，则能扩增出多个大小为bp的DNA片段。图2中的1和2代表转基因小鼠的两种检测结果，出现第种结果的小鼠为GH/tPA双转基因小鼠。

(4) 选取处于泌乳期的GH/tPA双转基因和tPA单转基因小鼠，统计分析两种转基因小鼠乳腺中tPA的表达情况，结果见下表。结果证明了。

转基因小鼠tPA表达情况分析表

	tPA单转基因小鼠	GH/tPA双转基因小鼠
表达水平（μg/mL）	16.3～82.5	112～423

实验探究题困难