1.
转基因植物的生物安全问题一直是人们争议的焦点，其中标记基因是安全风险来源之一，因此作物转基因后删除标记基因具有重要的意义。有报道发现，雌激素诱导的 Cre/loxP重组系统可以利用在加有雌激素的条件下，Cre 酶定位定向地删除转基因作物中位于 2 个 loxP 位点中的基因序列，且使得2个 loxP 位点重组为1个loxP 位点，如图1所示。某科研小组利用该重组系统获得无标记基因的转耐低磷G基因的大豆，图2中P1~P6代表引物，其中引物P1与相应启动子互补，P2 与 XVE基因序列互补，P3、P4是根据NPTⅡ基因(标记基因)序列设计的特异性引物，P5、P6是根据目的基因G序列设计的特异性引物。整个实验大体流程如下，请回答相关问题：
(1)
构建含G基因的重组 Ti质粒：为了获取耐低磷G基因，该科研小组设计引物进行PCR扩增，产物经电泳染色后发现不止一个条带，从PCR 循环过程分析可能的原因是。经过后期的改进，获得了大量的G基因。接着利用酶将经酶切后的G基因及质粒成功构建出重组 Ti质粒， 如图2。
(2)
将重组 Ti质粒导入农杆菌并筛选：先利用的低温、低浓度氯化钙溶液制备感受态农杆菌，然后将重组 Ti质粒转入到感受态农杆菌。为了提高该转化效率，需要考虑的因素有 (A.温度 B.时间 C.重组质粒的浓度 )D.农杆菌的种类和状态)。判断导入是否成功，可先向农杆菌菌液中加入新鲜的液体培养基，并置于摇床上慢速培养一段时间，接着利用 法将菌悬液接种至选择培养基上进行培养，最后挑取单菌落进行后续的鉴定。
(3)
转化大豆子叶并筛选：将成功转化的农杆菌与无菌大豆子叶进行共培养，适宜时间后将大豆子叶转移至添加有的培养基中进行筛选，获得成功转化的大豆子叶。再经形成愈伤组织，愈伤组织经过器官发生途径或途径进一步分化形成大豆苗。
(4)
获得标记基因删除的大豆苗及相关检测：将转化的大豆苗种植后收获种子，再将种子消毒并接种在含有的MS 培养基中培养一段时间，获得标记基因删除的大豆苗。接着提取该大豆苗的基因组 DNA，提取过程中为了防止DNA 被酶解以及更好的使蛋白质与DNA分离，需要在提取试剂中加入(填具体物质)。 最后将提取到的DNA作为模板，利用图2中的引物进行 PCR 检测，理想情况下能扩增出条带的引物对有。
(5)
转基因大豆苗的鉴定：为了直接判断转基因大豆是否成功，请写出简要的实验思路。
【考点】
PCR技术的基本操作和应用;
植物组织培养的过程;
基因工程的操作程序（详细）;
能力提升
