研究表明羊乳中的β-乳球蛋白（BLG）是人体主要过敏源，图为研究人员利用基因编辑技术敲除山羊中BLG基因同时敲入人乳铁蛋白（hLF）基因并获得转基因山羊的操作过程。图中sgBLG/Cas9复合物中，sgBLG为能准确识别图中山羊DNA特定序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。检测发现过程②中，hLF基因成功插入在母羊乙成纤维细胞中的一条常染色体上。

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1. 研究表明羊乳中的β-乳球蛋白（BLG）是人体主要过敏源，图为研究人员利用基因编辑技术敲除山羊中BLG基因同时敲入人乳铁蛋白（hLF）基因并获得转基因山羊的操作过程。图中sgBLG/Cas9复合物中，sgBLG为能准确识别图中山羊DNA特定序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。检测发现过程②中，hLF基因成功插入在母羊乙成纤维细胞中的一条常染色体上。

(1) Cas9蛋白类似于基因工程中常用到的酶，但Cas9蛋白与该酶的主要区别是。

(2) 图中复合物1所识别的DNA序列为5'-TATACTGGC-3'，则sgBLG的序列为5^'--3^'。

(3) 下列技术中，过程①②可能运用的技术有，过程③④⑤中，运用到的技术有。（编号选填）

a.显微注射技术 b.动物细胞培养技术 c.胚胎移植技术 d.DNA重组技术 e.动物细胞融合技术 f.细胞核移植技术

(4) 科研团队想进一步获得纯合能稳定遗传“人乳铁蛋白基因”的转基因山羊，其技术路线的设计思路是。

【考点】

基因工程的应用; 基因工程的基本工具（详细）; 基因工程的操作程序（详细）;

【答案】

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综合题普通

1. HNP1是人的一种抗菌肽蛋白，具有增强机体免疫力功能。某畜牧研究所利用CRISPR/Cas9技术生产乳腺特异性分泌HNP1的基因编辑山羊。根据特异性表达于山羊乳腺的β－酪蛋白（β－CN）第一外显子序列设计和构建特异性sgRNA，Cas9蛋白在sgRNA引导下切割β－CN的双链，使其断裂，促使细胞启动自然的DNA修复过程，以包含HNP1基因的同源重组载体为模板DNA，将HNP1基因精准编辑到山羊基因组，通过山羊乳腺生产抗菌肽蛋白。回答下列问题：

(1) CRISPR/Cas9是应用最广泛的基因组编辑技术。Cas9蛋白与sgRNA形成的复合物与基因工程操作工具中的功能类似，该工具通过发挥作用。

(2) 将制备的特异性sgRNA，Cas9mRNA以及包含HNP1基因的同源重组载体通过的方法导入山羊的受精卵，由受精卵发育成的转基因山羊可通过分泌乳汁来生产HNP1，该山羊称为。该种方法可让山羊批量生产HNP1，但也有不足之处，如（答出1点即可）。

(3) 根据特异性表达于山羊乳腺的β－酪蛋白（β－CN）第一外显子序列设计和构建特异性sgRNA的目的是。

(4) 若要验证基因编辑山羊中含有HNP1基因，简要的实验思路是。

综合题普通

2. Cre—loxP系统通过对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，由Cre酶和loxP序列两部分组成，其原理是Cre酶能识别loxP位点（特定的DNA序列），并使loxP位点间的基因序列被重组或删除，如图1所示（图中箭头表示Cre酶的作用位点）。

(1) loxP位点是一段长为34bp的序列，具有方向性，结合图1，推测其方向性由区段（填字母）决定。从作用结果分析，Cre酶同时具有类似（填酶的名称）的作用。

(2) 用基因工程技术培育抗虫抗除草剂水稻可减少因虫害和杂草造成的产量损失，为了增强食品安全性，科研人员利用Cre—loxP系统和组织特异性启动子 $\text{[math]}$ 驱动Cre酶基因在胚乳中特异性表达，从而培育出了能够特异性删除种子胚乳中外源基因的转基因水稻品系，过程如图2所示。

图2中，过程①使用的限制酶是，选择 $\text{[math]}$ 作为抗虫基因特异性启动子的优点是。

(3) 科学家提取了转基因水稻的叶肉细胞和胚乳细胞，利用两种基因探针分别对两种细胞的DNA和mRNA进行了检测，结果如下表所示（说明：“+”表示检测发现相应的分子，“—”表示检测未发现相应的分子）：

检测的2种细胞	crylC基因、EPSPS基因	cryIC基因的mRNA	EPSPS基因的mRNA
叶肉细胞	++	+	+
胚乳细胞	--	-	-

该技术运用的原理是，培育的转基因水稻胚乳细胞中无EPSPS基因和cry1C基因，其机理是。

综合题困难

3. 科研人员利用图1所示材料构建重组质粒并导入大肠杆菌，以期获得能监测生物组织或环境中四环素水平的“报警器”。限制酶识别序列及切割位点如下表。TetR基因是一种转录调节基因，GFp基因为绿色荧光蛋白基因，Amp^r为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制原点。请回答下列问题：

限制酶	EcoRⅠ	XbaⅠ	SpeⅠ	BamHⅠ
识别序列及切割位点

(1) 使用工具酶拼接DNA片段1和2，拼接后的片段连接处部分序列为5＇3＇（写出6个碱基），TetR基因和GFP基因转录的模板链（“是”或“不是”）该拼接DNM的同一条链。

(2) 构建重组质粒时，选择对质粒和拼接的DNA片段进行酶切，在DNA连接酶的作用下恢复键。再根据的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。

(3) 将重组质粒导入经理的大肠杆菌后，在含的固体培养基中筛选出工程菌。

(4) 工程菌监测四环素的原理如图2，当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌（能/不能）发出荧光，其原因是。

综合题普通