脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种特有成分，能诱发炎症反应。CD14蛋白是LPS的受体，能识别并结合LPS，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。为制备抗CD14蛋白的单克隆抗体，研究人员通过基因工程构建了含有CD14蛋白基因的重组表达载体，如图1所示。制备抗CD14蛋白的单克隆抗体的过程如图2所示。回答下列问题：

1. 脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种特有成分，能诱发炎症反应。CD14蛋白是LPS的受体，能识别并结合LPS，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。为制备抗CD14蛋白的单克隆抗体，研究人员通过基因工程构建了含有CD14蛋白基因的重组表达载体，如图1所示。制备抗CD14蛋白的单克隆抗体的过程如图2所示。回答下列问题：

(1) 限制酶XhoI和SalI切割DNA产生的黏性末端（填“相同”或“不相同”），用这两种酶处理CD14蛋白基因和载体后，再用酶进行拼接。

(2) CD14蛋白基因插入载体时，会形成正向连接和反向连接的两种重组载体。用XhoI和SalI进行酶切，对CD14蛋白基因插入后的连接方向进行鉴定。若重组载体能被再次切开，则说明CD14正向接入载体。若重组DNA不能被再次切开，则说明CD14反向接入载体。判断的理由是。

(3) 从培养液中收集CD14蛋白并对小鼠进行免疫接种。图2中，过程②用灭活的病毒处理，其目的是。过程④常用对抗体进行专一性检测。

(4) 图2中，过程⑥是从小鼠的中提取抗CD14蛋白的单克隆抗体，这些抗体可减轻革兰氏阴性细菌入侵导致的炎症反应，其原理是。

【考点】

基因工程的基本工具（详细）;

【答案】

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综合题普通

1. 某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。

回答下列问题：

(1) 与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞）（填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是。

(2) 在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对和生长具有抑制作用。

(3) 单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是。

(4) 构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是。

综合题普通

2. 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

限制酶

BamHⅠ

HindⅢ

EcoRⅠ

SmaⅠ

识别序列及

切割位点

(1) 一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有、个游离的磷酸基团。

(2) 要用图1中的质粒和图2中外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是。

(3) 与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止。

(4) 为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。

(5) 重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。

综合题普通

3. 如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图中所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是AOX1基因的启动子和终止子]。请分析回答下列问题：

(1) 为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上，这样设计的优点是

。

(2) 酶切获取HBsAg基因后，需用将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取。

(3) 步骤3中应选用限制酶来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。

(4) 为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用技术进行检测。

(5) 转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

综合题普通