1.
高等植物中的乙烯生物合成受到发育阶段和环境的共同调节，其中乙烯合成酶在这一过程中起到至关重要的作用。拟南芥乙烯合成酶相关基因主要有两种：AtACS4和AtACSS为研究以上基因表达水平与发育阶段的关系，科学家将AtACS4和AtACS5的基因分别和GUS报告基因融合，并转入拟南芥。图1为使用的载体图谱，kan'为卡那霉素抗性基因，Amp'为氨苄青霉素抗性基因。据此回答下列问题：
| 幼嫩根 | 幼嫩叶 | 成熟根 | 成熟叶 |
AtACS4 |
| 艹 | ++ | ++++ |
AtACS5 | + | ++++ | ++ | ++ |
注：+越多，表示GUS基因产物经染色后颜色越深
(1)
目的基因的克隆：根据AtACS4和AtACS5序列信息，设计引物对目的基因PCR扩增，对扩增产物进行电泳。制备凝胶时选择合适的梳子来制备样品孔，插入齿梳的时间应在琼脂糖凝固(“前”或“后”)。电泳过程中，凝胶点样孔端应靠近电泳槽极接口，电泳完成后切胶回收DNA，测序验证。
(2)
构建重组DNA分子：测序后可知所得条带确为实验所需条带且无突变。为使目的基因正确插入载体相应位置，设计引物时，在目的基因两端分别引入两种限制酶的识别序列。用酶处理PCR所得的DNA片段与空载体(未插入目的基因的载体)，可获得重组DNA 分子。
(3)
将重组DNA 导入农杆菌：用氯化钙处理后的农杆菌，发生了变化，成为感受态细胞。低温下将农杆菌与重组DNA混匀，使外源DNA粘附与受体细胞表面，最后短暂热刺激，使外源 DNA 进入受体细胞。将受体菌接种在(“含”或“不含”)抗生素的培养液中，慢速培养一段时间，使细胞恢复回正常状态，并表达相关基因。两小时后，再将农杆菌溶液涂布于添加了的LB平板进行筛选。
(4)
农杆菌转化拟南芥：将转基因农杆菌与消毒处理拟南芥叶片共同培养，共同培养后的拟南芥叶片转入含氨苄青霉素的固体培养基，进行多次培养，主要目的是除去农杆菌和筛选转化的植物细胞。若培养基中氨苄青霉素浓度太低，可能会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行检测。经过发芽和生根培养后的组培苗，在移栽大田前需进行炼苗，炼苗的作用是。
(5)
拟南芥乙烯合成酶的表达特点：使用GUS染液染色后，具GUS基因表达产物的部位会现蓝色，用肉眼可看到，且一定程度下染色深浅可反映出GUS基因的表达水平。使用GUS染液对不同发育阶段的两种转基因拟南芥进行染色。AtACS4和AtACS5的启动子和GUS报告基因融合后进行转化、染色后获得的实验结果如上表，可以推测启动子在幼嫩植铢的叶片中表达量更高，AtACS4在根中的表达情况是。
【考点】
培养基对微生物的选择作用;
基因工程的操作程序（详细）;
，EcoR V酶切出来的线性载体P1为末端。