DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。在PCR反应的早期10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA，当后期数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。

1. DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。在PCR反应的早期10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA，当后期数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。

(1) 若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物；PCR反应缓冲体系中一般要添加以激活耐高温的DNA聚合酶。

(2) 进行最初10-15个循环的目的是。如果体系中原模板DNA的数量为a，最初10次循环产物为双链，后15次循环产物为单链，则最终获得的单链探针数为。因为DNA单链与双链的分子量不同，可通过将单链探针DNA分离出米。

(3) 为精确控制产物生成量，科学家尝试设计了较长的非限制性引物与较短的限制性引物，在进行一定的循环次数后，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合。高复性温度条件下限制性引物不能结合模板链的原因是。

【考点】

PCR技术的基本操作和应用;

【答案】

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综合题困难

1. 普通PCR在扩增DNA的过程中存在一定概率的碱基错误配对，得到部分的错误产物。巢式PCR是一种在普通PCR基础上改良的新型PCR技术，扩增的精确性比普通PCR更高。巢式PCR对目标DNA进行扩增时需要用到两对不同的引物，首先使用第一对引物（外引物）对目标DNA进行第一次扩增得到中间产物，然后使用第二对引物（内引物）对中间产物进行第二次扩增得到目标产物，过程如图所示。请回答相关问题：

(1) PCR的原理是，PCR反应体系一般都需要加入一定量的，其作用是。

(2) 巢式PCR通常在第一支试管中进行第一次扩增，然后把得到的中间产物分离出来转移到另外一支试管中进行第二次扩增反应，两次扩增不在同一支试管中扩增的原因是。使用琼脂糖凝胶电泳对模板DNA与中间产物分离时，由于中间产物的分子量较小，所以相同时间内在凝胶中的迁移距离更。

(3) 如果巢式PCR第一次扩增得到的某中间产物的部分碱基发生了替换，则第二次扩增时内引物与该中间产物配对并扩增的概率。如果想进一步减少错误目标产物的产生，还可以适当（填“提高”或“降低”）复性的温度。

综合题普通

2. 2022年12月7日，疫情防控“新十条”发布，从此，全员核酸检测成为了历史。核酸检测报告单结果分为检出和未检出，即阳性和阴性。RT-PC℉检测大规模应用于新冠感染筛查中。其检测流程包括核酸提取、扩增、数据处理及报告，整个流程需4小时或更长时间，其速度快、操作流程简单、满足大规模的筛查以快速获得新型冠状病毒核酸是否为阳性的初步证据。RT-PCR加入Taqman荧光探针可以通过测定荧光强度来检测产物浓度，原理如下：Taqman荧光探针为一段与目的基因互补的核苷酸单链，两端分别连接一个荧光基团R和一个淬灭基团Q。探针结构完整时，R发射的荧光被Q吸收；而PCR扩增时结合在模板链上的探针被切断，使R和Q分离，R基团发射的荧光不被淬灭，这样通过对荧光信号强弱的监测就可实现对产物的检测。荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数少，获得的核酸产物含有病毒的概率越大。测某基因的C值是指将某目的基因与过量的荧光素混合后放入PCR反应体系中，随PCR产物的积累，将荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数称为Ct值。不同的样本，数值不同。请回答下列问题：

步骤		温度	时间	循环数
1	逆转录	50℃	10min	1cycle
2	预变性	95℃	5min	1cycle
3	变性	95℃	10s	40cycle
3	退火/延伸/检测荧光	55℃	40s	40cycle

(1) 新型冠状病毒是一种RNA病毒，因此，在核酸提取后，进行RT-PCR时需要加入的酶是和。

(2) 图甲为某中学核酸检测中7支单管样品的结果图片，图乙是C值图解。图甲中阴性参照组为第组。原始病毒核酸载量更高的组为第组，原因是：。

(3) 临床上，将症状及影像学结果高度疑似、核酸多次检测为“阴性”的现象称为检测结果“假阴性”，导致“假阴性”结果可能是由于（填序号）。

①检测者处于感染初期 ②检测者感染时间较长③样本采集位置不规范 ④样品稀释度不足 ⑤病毒出现变异

综合题普通

3. 在聚合酶链式反应（PCR）中，除了作为复制对象的长链DNA之外，反应溶液中还添加有作为引物的短链DNA、dNTP（脱氧三磷酸核苷酸，N表示任意某一种碱基）和酶。实验时需要使反应溶液的温度周期性地发生变化以完成“变性—复性—延伸”的循环。DNA复性温度与互补碱基对之间的氢键数呈正相关。

(1) PCR反应溶液中添加的酶为，作用是。

(2) 实验1：在图1的引物1到引物4中，只使用1种作为引物，复性的温度设定为T℃，PCR后只合成出了与模板DNA2相同的单链。该实验使用的引物是。

实验2：将引物变更为图1中的引物3和引物4，其他条件与实验1相同的情况下进行PCR双链DNA完全没有被复制，请在答题卡中，将引物3和引物4与模板链结合的关系绘制出来。

(3) 实验3：对图2中的双链DNA，使用引物5和引物6，将复性的温度设定为T℃，进行了PCR。结果是双链DNA完全得不到复制。而当设定温度改变后，双链DNA得到了复制。温度改变的大致思路是。

(4) 实验4：PCR技术与电泳鉴定结合进行DNA测序。以待测序的DNA链作为模板链，使用3^'TATA……ATGCGCA-5^'末端结合了高灵敏度检测化合物X的DNA单链序列作为引物，在第1次实验中，用dNTP进行反应。第2次实验，在第1次实验使用上述dNTP的基础上，将反应混合物分为四个试管，分别加入四种双脱氧三磷酸核苷酸即ddNTP，即核苷酸在2、3号都脱氧（ddATP、ddCTP、ddTTP、ddGTP，结构见图4），每个试管只加一种。第1次与第2次实验四支试管，在经过相同的温度变化循环后，对反应溶液进行了适当的处理，使全部的DNA以单链DNA的形式存在。使用能区分开一个碱基长度差异的凝胶电泳法对含有化合物X的单链DNA进行分析，获得了如图5所示的结果。

①ddNTP一旦参与聚合反应，则DNA单链延伸即终止，原因是。

②请根据下图写出模板链碱基序列：

综合题普通